基于质谱的组织样本鸟枪法蛋白质组学综合工作流程

准确的蛋白质定量测量对于理解蛋白质之间的动态和空间协作，进而揭示疾病背后的生物学机制至关重要。本实验的总体目标是为组织样本提供一个整合的定量蛋白质组学工作流程，结合无标记和基于标记的蛋白质谱分析方法，用于生物标志物的发现。在本研究中，我们使用 Orbitrap Fusion 仪器，采用基于标记和无标记的方法对蛋白质进行定量。

组织裂解是LC-MS-MS实验成功最关键的步骤之一。取30 mg组织置于珠磨管中，用PBS洗涤后，加入300微升含有8摩尔尿素、Tris、NaCl和MgCl2的尿素裂解缓冲液。

使用探针式超声波破碎仪裂解组织内容物。重复此步骤一个循环。若在管底观察到任何完整组织，向管中加入氧化锆珠，并使用珠磨机均质组织，持续90秒，期间在冰上孵育5分钟。

在4°C条件下，以约6000 G离心15分钟，使细胞碎片与上清液分离。将上清液收集至新的离心管中，并混匀溶液。使用Bradford试剂定量测定组织裂解液中的蛋白质浓度。

为此，在595纳米处测定样品的OD值，并利用此屏幕上显示的标准曲线进行推算。蛋白质定量后，取10微克组织裂解液在12% SDS-PAGE凝胶上电泳，以检测裂解液的质量。溶液内消化的第一步是使用TCEP还原二硫键。

加入TCEP后，将离心管中的内容物在37摄氏度下孵育一小时。下一步是进行烷基化，以防止还原的二硫键重新形成。加入碘乙酰胺等烷基化试剂，并将离心管在避光条件下孵育10分钟。

孵育后，用四到八倍体积的稀释缓冲液将尿素的终浓度降低至低于一摩尔。此时，建议检测pH值。下一步是向离心管中加入胰蛋白酶，并在管中过夜孵育以实现高效消化。

第二天，使用真空浓缩仪将消化后的肽段干燥，并进行脱盐步骤。为进行肽段脱盐，使用C18阶段小柱。通过加入50微升甲醇活化C18阶段小柱，然后在1000 × g下离心小柱2分钟。

现在，加入 50 µL 含 0.1% 甲酸的乙腈以洗涤 Stage Tip，再次离心该 Tip。将干燥的消化后肽段重新溶解于 50 µL 0.1% 甲酸中。将重悬的肽段加入已活化的 Stage Tip 中。

重复此步骤至少四次。洗涤样品时，加入 50 µL 0.1%甲酸，重复离心步骤。洗脱肽段时，加入 50 µL 含 0.1%甲酸的 40%乙腈溶液，通过离心使溶液穿过 Stage Tip。

使用含 0.1% 甲酸的 50% 和 60% 乙腈重复此步骤，并将滤液收集至新的离心管中。使用真空浓缩仪将脱盐后的肽段干燥。在进行液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）分析前，采用 Scopes 方法对肽段进行定量。

为此，将2 µL重建后的样品加入微滴板的孔中，测定205纳米和280纳米处的吸光度。根据本幻灯片所述公式计算浓度。脱盐后的肽段干燥后，即可用于基于标记的定量分析。

进行iTRAQ标记时，必须将干燥的肽段重新溶解于iTRAQ标记试剂盒中提供的溶解缓冲液20 µL中。通过加入试剂盒中提供的小瓶内的乙醇来重悬标签试剂，并充分混匀。建议所有步骤均严格按照制造商的说明书进行操作。

将均匀混合的iTRAQ标签分别加入对应的离心管中，并进行标记反应。反应结束后，通过加入质谱级水淬灭管中多余的未结合标签，并孵育半小时至一小时。随后，将所有标记后的样品转移至同一管中，并干燥标记的肽段。

将样品用0.1%甲酸重悬后，打开NanoLC自动进样器，将样品放入自动进样器中。样品放置完毕后，需正确设置液相色谱和质谱的参数。以下介绍基于LC-MS的非标记定量和iTRAQ定量所使用的参数。

对于无标记定量，采用120分钟梯度，因为仅注入单一未分级样品。根据样品复杂性，该时长可适当延长或缩短。本实验中，设定流速为每分钟300纳升，并对溶液B（本例中为含1%甲酸的80%乙腈）采用以下梯度。

同样，我们可以为 iTRAQ 实验设置梯度洗脱程序。由于样品未经分级处理，因此采用了 90 分钟的梯度。基于标签的 iTRAQ 定量以及非标记定量的质谱参数均可在此查看。

第一步是通过单击全局参数来设置应用模式。选择肽段模式，并根据所用的液相色谱梯度设置方法持续时间。定义实验的扫描参数。

单击 MS-OT 选项后，参数将显示出来。所使用的检测器类型已设置为 Orbitrap。该仪器上可用的其他选项包括离子阱。

分辨率已设置为60,000，可根据实验需求和类型在可用的不同选项之间进行选择。质量范围为正常，扫描范围设置为375至1700。其他参数采用MS应用的默认设置。

已设置强度阈值，电荷态设定为二至六的范围。动态排除时间设置为40秒，质量容差保持为10。下一组参数包括MS-MS参数。

已选择四极杆作为隔离模式，隔离窗口设置为2，隔离偏移设置为关闭，蛋白质组学实验中的激活类型通常为HCD。碰撞能量可以设定为固定值，也可以进行辅助调整。标记样品需要更高的碰撞能量，因此对于iTRAQ实验，建议将碰撞能量设置为35；而对于LFQ实验，则可设置为30。

此处使用的检测器类型为Orbitrap。扫描范围模式将设置为自动。其他参数采用iTRAQ实验和非标记定量实验的默认设置。

点击摘要可查看实验中使用的所有液相色谱和质谱参数的概览。您可以逐一检查每个参数并进行校对。完成后，点击文件并将其保存为方法文件。

保存后，即可运行该方法，从而获得原始文件。随后可使用 Proteome Discoverer 软件分析这些原始文件。此图显示了牛血清白蛋白（BSA）在三次技术重复中的序列覆盖度，三次重复的覆盖度均为 91%。

这表明了仪器的可重复性。该图显示了在三个不同的生物样本中鉴定出的肽段谱图匹配数、肽段数和蛋白质数的一致性，再次反映了仪器的可重复性。此处，维恩图展示了在无标记实验和基于标记实验中，三个不同样本中共同存在和独有的蛋白质。

这些条形图显示了在 LFQ 和 iTRAQ 实验中，经过 1% FDR 筛选后鉴定出的肽段谱图匹配数、肽段组数、总蛋白数、蛋白组数以及蛋白数量。生物样本的组织蛋白质组学使我们能够探索与疾病进展不同阶段相关的新潜在生物标志物。所述的组织定量蛋白质组学分析方案可提供可重复且覆盖度良好的数据。

使用技术重复可确保良好的可重复性，即使样本在不同时间点进行检测。本文展示了利用两种定量方法对组织样本进行分析：非标记法和基于标记的蛋白质组学方法。定量蛋白质组学技术的选择可能取决于样本数量、质谱平台的可用性以及拟解决的生物学问题。