人眼供体后段中调控眼内压与颅内压的跨层自主系统模型
2020年4月24日
我们描述并详细说明了经筛板自主系统的使用。该系统利用人体眼球后段，独立调节眼内压（眼内）和视神经周围颅内压（颅内压），从而产生一种模拟青光眼性视神经病变特征的经筛板压力梯度。
这种新型的眼部经筛板自主系统利用人眼后段独立调节眼内压和颅内压，从而形成经筛板压力梯度。该TAS模型能够在体外、临床前条件下评估人颅内压，而这种研究在此前无法实现。该模型有望用于研究青光眼、创伤性脑损伤、特发性颅内高压以及与太空飞行相关的神经-眼部综合征等疾病。
安装灌注液进样注射器时，取一支30毫升注射器，加入30毫升所需灌注液，并在注射器上连接一个三通旋塞阀。将一个0.22微米亲水性滤器连接到旋塞阀上，再将一个15号鲁尔接头适配器连接至0.22微米亲水性滤器。排除注射器系统中的气泡后，将管路连接至鲁尔接头适配器，并使用无通气孔的通用锁帽封闭旋塞阀的侧端口。
按照上述方法设置第二个进液注射器后，将一个注射器通道标记为ICP通道一，另一个注射器通道标记为IOP通道二。然后按照上述方法设置出液注射器，但不要向注射器中加载灌注介质。准备人全眼球样本时，去除视神经鞘并从后段移除玻璃体。
为了确保后段组织与眼内压（IOP）腔室的圆形穹顶贴合良好，可根据需要修剪多余的巩膜，并使用镊子确保视网膜均匀铺展在后段组织的内表面。然后将组织段放置于TAS系统的IOP腔室的圆形穹顶上，视神经朝上，并使用环氧树脂O型圈和四个螺钉密封后段组织。设置IOP腔室时，将管路插入腔室的进液口和出液口，并将IOP灌注用注射器插入进液口。
将空的IOP流出端注射器装置插入流出端口，使用推注/抽吸方法缓慢将灌注液注入流入端口，以填充后部眼杯，同时通过流出端注射器缓慢抽出灌注液，以清除管路中的所有气泡。当流入和流出管路均无气泡后，停止灌注，并将旋塞阀关闭并锁定在关闭位置。从IOP流入端滤器组件上取下注射器，向注射器中重新加入30 mL额外的灌注液，然后将注射器装置重新插入滤器组件中。
为建立颅内压（ICP）腔室，将腔室置于后段巩膜后方，注意使视神经位于上腔室内，然后用四枚螺钉密封上腔室。将导管插入ICP腔室的进液口和出液口，将ICP输入注射器连接至进液口，将空的ICP流出注射器连接至出液口，随后用培养基冲洗系统，操作方法如前所述。为设置数据记录系统，打开八通道电源和计算机，启动数据采集软件。选择“文件”菜单中的“新建”，然后选择“设置”和“通道设置”。
选择三个通道，并按指示重命名通道。所有通道的量程均设置为两毫伏，在计算列中，通道一和通道二选择“无计算”。通道三选择“算术”计算，在公式窗口的“通道”下选择 Ch 2。
在“功能”下选择“数学”和“减号”，在“通道”下选择“通道 1”。为设置和校准静水压传感器，将静水压传感器连接到连接至多通道桥式放大器的传感器管线上，并将一个空的 30 毫升注射器连接到通道一颅内压（ICP）压力传感器的侧端口。将一个血压计连接到通道一 ICP 压力传感器的底部，然后点击采样时间旁边的箭头，将采样速度设置为 100。
选择桥接放大器（Bridge Amp）、主滤波器（Mains filter）和零点校准（Zero），等待系统完成归零，期间注意不要移动压力传感器。接着捏住压力传感器的白色卡扣，通过传感器加压，直至血压计显示达到40毫米汞柱（mmHg），然后松开白色卡扣，取下注射器和血压计。在单位转换页面，选择负值（minus），并高亮显示最高平台期，以标定为40毫米汞柱。
点击 0.1 的箭头，输入 100，高亮最低的平台以表示零毫米汞柱。点击 0.2 的箭头，输入 0，选择单位为毫米汞柱，然后点击“确定”。在 Bridge Amp 窗口中，点击“确定”，并按照上述方法校准通道二眼内压的静水压力传感器，最高平台使用 100 毫米汞柱，最低平台使用 0 毫米汞柱。
将TAS后段单元连接至数据采集系统时，先将TAS后段单元放入37°C、5% CO₂的培养箱中，然后将ICP测压管路从一通道ICP压力传感器的出口端连接至相应接口。再将IOP测压管路从出口端连接至二通道IOP压力传感器。在Chart View页面中，点击“开始采样”，并将采样速度设置为“慢速”和一分钟。
然后根据实验方案要求，上下调节铁架台上的注射器以调节ICP和IOP压力，或将其置于灌注泵上以控制压力。在此代表性分析中，通过多种IOP和ICP条件测试了两个腔室内平均正常压力差的维持情况。为确保组织的活性，每48小时更换一次组织中的培养基。
在培养基更换时仅出现轻微的压力升高，且通过实验第14天和第30天的免疫组织化学分析及IV型胶原表达观察发现，该压力变化未影响视神经乳头的存活率或形态。通过在不同时间点升高眼内压（IOP）或降低颅内压（ICP），可维持七天的跨筛板压力梯度升高范围。在持续七天的跨筛板压力梯度升高后，可在后部节段观察到杯状凹陷形成及组织增厚现象，IV型胶原表达显示小梁结构增厚，且在整个实验期间信号表达增强。
相位成像显示，在对照组节段中，神经节细胞层内视网膜神经节细胞健康，无杯状凹陷；而在跨膜压力梯度升高的培养样本中，可见广泛性杯状凹陷，视网膜神经纤维层内无残留的视网膜神经节细胞，且细胞外基质发生显著重塑。该技术将使研究人员能够有效研究生物力学疾病模型，并发现针对人眼跨膜压力的分子致病机制。
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概述
本研究介绍了一种新型的眼部跨层自主系统（TAS），旨在独立调节眼内压和颅内压。通过建立跨层压力梯度，该系统拟模拟青光眼性视神经病变，用于研究影响颅内压的眼部疾病及相关状况。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 眼科学
- 神经生物学
背景
- 与视神经健康相关的压力梯度研究。
- 研究颅内压在眼病中的重要性。
- 对青光眼和创伤性脑损伤等疾病状态的探索。
研究目的
- 建立一个用于研究眼内和颅内压力差异的系统。
- 提供一个用于探究与压力变化相关疾病的模型。
- 增进对眼内压与颅内压之间潜在相互作用的理解。
使用的方法
- 利用跨层自主系统（TAS）进行压力调节。
- 制备人眼样本以建立受控的实验装置。
- 监测并校准压力传感器，以采集眼内压（IOP）和颅内压（ICP）数据。
- 使用灌注和引流注射器进行灌注液交换和压力管理。
主要结果
- 在TAS模型中成功建立了平均正常压力梯度。
- 在液体交换过程中压力扰动极小，维持了组织活力。
- 观察结果包括在整个实验时间线上视神经头部形态的稳态行为。
结论
- 该研究证明了使用TAS模型进行眼压研究的可行性。
- 该研究强调了其在理解青光眼及相关疾病方面的潜在应用价值。
- 对于未来关于压力相互作用及其对视神经健康影响的研究具有重要意义。
常见问题
行业重要性概述
跨巩膜自主系统（TAS）通过实现对人尸体眼后段眼内压和颅内压的独立调控，解决了眼科及神经眼科研究中一项关键而尚未满足的需求。该离体模型通过维持视神经乳头组织的结构与复杂性，支持对与青光眼、创伤性脑损伤、特发性颅内高压以及航天相关神经-眼综合征相关的治疗假说进行机制性风险评估。该系统提供了一个与疾病相关的研究平台，减少了对动物模型的依赖，增强了从发现到临床前验证的转化连续性，从而提高了临床前靶点验证的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过调节跨巩膜压力梯度，可在人体组织中研究与发病机制相关的病理范式，从而验证治疗假设。
- 操作价值：在可控压力条件下维持视神经乳头的完整性和结构复杂性，支持功能靶点的有效性验证。
- 预测价值：通过反映与人类压力相关性眼神经退行性疾病的病理生理学的疾病相关系统建模，提高靶点的可信度。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过建立稳定且可重复的压力控制环境，制备经过验证的人类眼后段组织，用于后续化合物的评估。
- 操作价值：利用校准的流体静压传感器和灌注液交换方案，独立调控眼内压（IOP）和颅内压（ICP），确保检测的标准化和可重复性。
- 可扩展性价值：通过每48小时更换一次培养基，可在不损害组织活性和形态的前提下实现平台的重复使用，支持长期纵向研究。
转化与临床前研究
- 转化价值：通过维持视神经乳头组织结构，并在跨膜压梯度升高的条件下实现对杯状凹陷、组织增厚及细胞外基质重塑的纵向观察，从而在从发现到临床前验证的全过程中保持连续性。
- 风险校准进展：通过在明确的时间点（例如七天）定量分析与压力诱导致病相关的结构和分子变化（如IV型胶原表达），支持决策推进或终止研究。
- 机制性风险降低：可在与人类相关的离体系统中研究以跨膜压为核心的生物力学疾病模型及分子致病机制。
流程与工作流整合
TAS 模型通过提供一种与人类相关且可调节压力的系统，将假说验证、检测准备和转化生物标志物的一致性整合到从早期靶点验证到临床前研究的整个发现过程中。
- 发现生物学：通过独立调控眼内压（IOP）和颅内压（ICP），产生与视神经乳头病变相关的跨筛板压力梯度，从而支持假设验证与通路阐明。
- 筛选：通过可重复的压力控制、组织活性维持，以及来自压力传感器和免疫组织化学分析的定量输出，实现检测就绪。
- 分析：提供定量的因变量测量（IOP、ICP、跨筛板压力梯度）和定性读数（IV型胶原表达、相位成像、组织形态），支持不同实验条件间的比较。
- 转化研究：在持续压力应激下，通过与疾病相关的杯状凹陷、视网膜神经节细胞丢失及细胞外基质重塑等观察指标，衔接临床前研究的连续性。
- 企业级复用：通过标准化设置、每48小时更换培养基，以及长达30天的长期培养活性，作为可重复使用的实验能力，支持多轮实验循环。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证的预测可信度，减少与压力相关的眼部神经退行性病变机制的模糊性，并建立与人类相关的病理生理学模型。
- 操作价值：实现压力调控和组织维持方案的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：优化决策流程，通过减少动物使用提高资本效率，并降低眼科药物开发中后期的生物学风险。
- 项目组合影响：基于跨筛板压力响应特征，结合人类组织形态学和生物标志物数据，对靶点进行风险校正后的优先排序及推进决策。
实施注意事项
- 需要具备眼组织处理、压力传感器校准以及培养基更换和系统设置过程中无菌操作技术的专业知识。
- 依赖于特定仪器设备，包括静水压传感器、多通道桥式放大器、灌注注射器、止流阀、过滤器，以及37°C、5% CO₂的培养箱。
- 要求团队间在压力操作规程、组织制备（视神经鞘和玻璃体去除）以及使用环氧树脂O型圈和螺丝进行密封的流程方面实现标准化。
- 需考虑供体间后段结构完整性、巩膜厚度和视网膜平坦度的个体差异，针对不同情况修剪组织，并使用镊子展开视网膜以实现与灌流腔的最佳匹配。
- 存在若干实际限制因素，例如需要精确的压力校准、避免液体管路中产生气泡，以及在更换培养基时监测最小压力变化，以维持组织活性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:44
Translaminar Autonomous System (TAS) Setup
1:42
Human Whole Eye Globe Preparation
2:24
IOP (Bottom) Chamber Setup
3:20
ICP (Top) Chamber Setup
3:52
Data Recording System Setup
6:56
Results: Representative Translaminar Autonomous System Model Analyses
8:26
Conclusion
