用于特异性快速检测罗非鱼湖病毒的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法

罗非鱼湖病毒是一种新出现的病毒性和传染性病原体，可导致罗非鱼及其杂交种群出现高死亡率。由于罗非鱼是许多发展中国家主要的蛋白质来源，该新病毒的感染对罗非鱼水产养殖业造成了重大影响，并威胁全球粮食安全。开发一种快速、准确且灵敏的检测鱼类组织中该病毒的方法，将有助于疾病控制，并减轻病毒带来的影响。

在本视频中，我们将展示用于快速检测鱼类样本中罗非鱼湖病毒的反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法。第二部分：RNA提取。首先，将3250毫克肝脏组织加入含有600至1000微升酸性硫氰酸胍-苯酚类试剂的无菌1.5毫升微量离心管中，并剪碎至均匀状态。

在10,000 RCF下离心30秒，将上清液转移至新管中。向管中加入等体积的95%乙醇，并充分混匀。将溶液转移至置于收集管中的离心柱中，然后在10,000 RCF下离心30秒。

弃去穿流液，将柱子转移至新的收集管中。向柱子中加入400微升RNA预洗液，于10,000 RCF离心30秒。弃去穿流液，并重复此步骤。

向柱中加入700微升RNA洗涤缓冲液，以10,000 RCF离心2分钟。随后，将柱转移至一个无菌的1.5毫升微量离心管中。最后，用100微升无核酸酶水洗脱RNA至柱基质中，并以10,000 RCF离心30秒。

第三部分，引物设计。PrimerExplorer Version 4 是设计高效 LAMP 或 RT-LAMP 引物最常用的生物信息学工具，其官方网站提供了详细的软件使用手册。本研究中，针对源自泰国的 TiLV 第 3 节段中的六个不同区域，设计了四条特异性引物，包括两条内引物和两条外引物。

进入视频中所示链接的网站后，点击 PrimerExplorer V4。选择包含 TiLV 第 3 节段序列的文件（该序列以 FASTA 格式从 GenBank 获取，登录号为 KX631923，或为罗非鱼湖病毒 TV1 第 3 节段），然后点击“Primer Design”按钮。点击“Generate”按钮后，软件将开始处理并显示结果。在针对 LAMP 扩增优化序列后，本研究共选定一对外引物和两对内引物，用于检测 TiLV 感染。

此处显示了这组引物。第四部分，罗非鱼湖病毒特异性逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）的演示。用于罗非鱼湖病毒的RT-LAMP反应主混合液包含以下化学试剂。

使用表格中列出的化学试剂配制预混液。将22 µL预混液加入无菌的1.5 mL微量离心管中。然后，向反应管中加入3 µL RNA模板。

对于阴性对照，使用蒸馏水代替RNA材料，并充分混匀。将反应体系在65摄氏度孵育60分钟，随后在80摄氏度孵育10分钟。孵育30分钟后，通过肉眼直接观察比色变化。

必要时，可通过在1.5%琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳来验证RT-LAMP检测结果，电泳条件为100伏恒压运行40分钟，同时加入1 kb DNA分子量标记物以确定片段大小。第五部分，代表性结果与解读。在30分钟孵育后，在365纳米波长的紫外光下可明显观察到感染样本中出现颗粒状荧光反应，表明鱼类组织中存在TiLV的阳性扩增，而阴性对照组则呈现澄清且略带无色的溶液。

相应地，通过琼脂糖凝胶电泳证实了RT-LAMP产物的扩增，在感染TiLV的样品中可见不同大小的倒置DNA重复序列的多重扩增产物，在紫外灯下形成茎环结构，而在阴性对照的加样孔中未出现条带，该结果与RT-LAMP检测结果一致。因此，为减少罗非鱼湖病毒（tilapia lake virus）的传播，立即采用有效的诊断方法对感染鱼类进行筛查是关键措施之一。因此，新建立的RT-LAMP检测方法可为生物安全防控流程提供一种快速且灵敏的诊断工具。

该检测方法既可在实验室中使用，也可在实地设施中应用。我们希望该方法能够用于筛查受罗非鱼湖病毒（Tilapia lake virus）感染的鱼类种群，从而有助于减少该病毒的传播。