利用分子动力学模拟解析EGFR体细胞激活突变的结构效应

分子动力学模拟是一种计算技术，可用于探索分子运动，并揭示对理解生物化学和细胞功能至关重要的构象变化。探究大分子可及的动态运动范围具有挑战性。将分子动力学模拟结果与实验数据结合，有助于评估这些运动的功能意义。

我们将通过分子动力学模拟，演示在癌症患者中观察到的突变如何影响EGFR的靶向构象及配体结合。为了准备野生型无配体活性EGFR的激酶结构，打开Kymera可视化程序，在文件菜单下点击“通过ID获取”，选择蛋白质数据库（Protein Data Bank），并指定PDB编号2GS2。为构建2GS2结构中缺失的结构元件，需从其他EGFR结构中获取这些片段。

为了构建EGFR中第746位谷氨酸至第750位丙氨酸（ELREA）的五残基缺失突变，请点击收藏、序列，然后点击显示序列，以打开野生型2GS2序列。在弹出的序列窗口中，点击编辑并添加序列，以选择缺失突变体的FASTA格式序列。在比对窗口中，选择结构与模型或同源性。

在弹出窗口中，指定 2GS2 复合物结构作为模板，突变序列作为待建模的查询序列，然后根据 zDOPE 评分和视觉检查从生成的模型中选择一个突变体模型。为准备野生型无配体非活性 EGFR 激酶结构，打开蛋白质数据库结构 2GS7，并从其他 EGFR 结构中添加缺失的片段，按示例方法对缺失突变体形式进行建模。为准备 ATP 结合的野生型活性 EGFR 激酶结构，使用蛋白质数据库结构 2ITX 作为主结构，利用其他 EGFR 结构构建缺失片段，并如示例所示使用建模工具对缺失突变体形式进行建模。

为了构建野生型EGFR不对称二聚体结构，在Kymera中打开2GS2，依次点击工具（tools）、高级结构（higher order structure）和晶胞（unit cell），将结构转换为包含激活激酶和受体激酶的不对称排列的生物组装体。选择2GS2结构并执行“生成副本”（make copies），然后从对称操作产生的多个二聚体副本中选取并保存一个单独的不对称二聚体。为了构建丙氨酸702突变为缬氨酸的突变体，选择工具（tools）、结构编辑（structure editing）和侧链构象（rotamers），将丙氨酸702替换为缬氨酸。

在 Maestro 中打开结构，点击蛋白质预处理向导按钮，然后选择添加氢原子并补全缺失的侧链原子，接着点击预处理。为确定在 pH 7.0 条件下可电离残基的质子化状态，点击优化，并使用 PROPKA 优化天冬酰胺、谷氨酰胺和组氨酸残基的取向以形成氢键，随后对结构进行能量最小化。为建立模拟体系，打开 LEAP 程序，导入 Amber FF14SB 力场和 TIP3P 水分子。

对于ATP结合体系，导入ATP的参数并加载结构。在八面体盒子中用显式TIP3P水分子对结构进行溶剂化，水分子延伸至蛋白质表面原子各方向10埃。检查带状系统，并添加必要的离子以使其中和。

为了充分模拟生物分子系统，向模拟体系中添加额外的钠离子和氯离子原子，使体系的盐浓度达到 0.15 摩尔浓度，然后生成并保存该体系的拓扑文件和坐标文件，作为后续生产性模拟的输入文件。使用 Amber 软件，首先对模拟体系进行能量最小化，以避免任何不利的构型。在最小化输入文件中，调整最大循环变量以设定总最小化循环次数，并设定循环次数以指定最陡下降算法的循环数。

使用 restraint weight 变量对由 restraint mask 参数指定的溶质原子施加限制力。分多步进行能量最小化，逐步将施加在溶质原子上的限制力从 25 降低至 0 千卡每摩尔埃平方，然后使用命令运行最小化。将体系从 0 升温至 300 开尔文，持续 100 皮秒，并使用命令在溶质原子上设置 10 千卡每摩尔埃平方的限制力。

然后使用命令执行加热过程。在等温等压系综下平衡系统900皮秒，并为长程静电相互作用设置9埃的距离截断值，逐步将溶质原子的限制力常数降低至0.1千卡每摩尔埃平方，最后通过一次无限制的5纳秒模拟完成平衡。按照所示命令运行平衡过程。

调整参数，使生产模拟运行 100 纳秒，并每 10 皮秒保存一次构象，然后按照指定命令运行模拟。为了可视化野生型和突变型 EGFR 激酶模拟过程中的构象采样，需在 Visual Molecular Dynamics 中打开 Amber 拓扑文件及相应的轨迹文件。利用合适的二级结构表示方法，分析记录轨迹中蛋白质的整体结构动态。

然后观察特定原子与残基之间的相互作用，例如催化必需的赖氨酸745与谷氨酸762之间的盐桥。或者，将模拟过程中采集的多个构象以蛋白质数据库（Protein Data Bank）格式保存，并在Kymera中打开这些构象。使用“matchmaker”功能将所有结构叠加到初始结构或中位结构上，并将中位结构以实心显示，其余对齐的结构则以半透明白色显示，以便更清晰地观察记录到的结构变化。

为了分析野生型和突变型EGFR的全局稳定性，并考察不同结构单元的柔性，需导入Amber力场类型及相应的轨迹文件。在均方根偏差输入文件中，指定初始结构的主链原子作为均方根叠合的参考。在均方根涨落输入文件中，指定初始结构的C-alpha原子作为均方根叠合的参考。

然后使用 CPPTRAJ 程序运行分析并绘制输出数据。或者，为了对构象集合进行比对，并根据每个残基的 C-α 原子根均方偏差进行着色，可在 Kymera 中打开构象，并使用 matchmaker 选项对其进行比对。选择工具、描绘，然后按属性渲染。

选择构象集合中的残基，并将Cα原子的均方根偏差设为属性，然后点击确定。构象的主链轨迹将根据结构稳定性的高低以蓝色、白色或红色着色，分别表示高、中、低稳定性区域。为分析ATP与野生型及缺失型EGFR之间的氢键相互作用，需准备一个CPPTRAJ脚本以执行该任务。仅针对分子间氢键进行分析，使用nointramol变量，并将氢键定义为供体与受体之间的距离小于或等于3.5埃、键角大于或等于135度。

为了评估分子内相互作用，例如催化关键的赖氨酸与谷氨酸残基之间的相互作用，需指定赖氨酸为氢键供体，谷氨酸为氢键受体，并按照指示运行脚本以分析结果。为了计算ATP与野生型及缺失型EGFR之间的结合自由能，需在LEAP程序中准备气相配体-受体及配体-受体复合物的蛋白质数据库（Protein Data Bank）文件，并将ATP设为配体，EGFR设为受体。将广义Born半径值设置为M Bond I2。随后为气相蛋白质数据库文件生成Amber拓扑结构和坐标文件。

类似地，为了计算野生型和702位丙氨酸突变为缬氨酸的EGFR中激活激酶与接收激酶之间的结合自由能，需指定接收激酶为配体，激活激酶为受体，并保存相应的拓扑结构和坐标文件。准备分子力学广义玻恩表面积输入文件，将IGB值设为2，盐浓度（saltcon）设为0.1。然后使用mmpbsa。

在 Amber 中提供有 py 脚本，按提示输入命令以执行结合能计算并分析输出数据。在此代表性的 100 纳秒模拟过程中，与野生型 EGFR 相比，丙氨酸 702 缬氨酸突变体显示出胞膜邻近 B 区段构象稳定性的增加，这可能是由于疏水相互作用更为紧密所致。丙氨酸 702 缬氨酸突变体在激活激酶与接收激酶之间的结合自由能也低于野生型 EGFR，表明其二聚体相互作用更为有利，有助于维持 EGFR 激酶的活性构象。

模拟缺失突变结果显示，与野生型EGFR相比，功能关键的αC-螺旋的C-α原子波动降低，延长了EGFR活性状态的持续时间。缺失突变还导致赖氨酸745侧链极性原子与谷氨酸762侧链极性原子之间频繁形成氢键，而这种相互作用相较于野生型EGFR是EGFR酶活性的关键因素。此外，缺失突变体中ATP与EGFR之间的氢键数量也多于野生型EGFR。

该缺失突变还导致EGFR非活性状态的αC-螺旋向内移动，这是一种在向活性状态转变过程中预期发生的结构变化。相比之下，野生型非活性EGFR的αC-螺旋则保持其初始构象。为了评估这些突变的影响，关键在于选择合适的结构构象状态，并对这些结构进行恰当的准备和平衡。

将分子动力学模拟与实验研究相结合非常重要，因为这些技术之间的协同作用有助于结果的解释，并可为后续的湿实验提供指导。