基于纸张的微囊泡和外泌体预浓缩与分离

在本实验方案中，我们描述了一种简单的制造纸质装置的方法，该装置称为XO Pad，旨在高效富集并分离细胞外囊泡。XO Pad是一种结构简单的装置，无需使用任何化学试剂或机械设备即可实现细胞外囊泡的预浓缩和分离，且其回收率高于传统方法。首先，使用打印机软件定义需要打印的区域。

设计应包含12个蜡图案层，其中圆形样品区域的直径从5毫米逐渐缩小至2毫米。随后，在纤维素纸两侧的指定区域打印疏水性蜡。将印有蜡的纸置于实验室烘箱中，在120摄氏度下加热80秒，然后使用切割机将印蜡纸切割成独立的XO Pad装置。

在最左侧和最右侧层的样品区域，分别滴加五微升和两微升的渗透选择性膜溶液。将涂有渗透选择性膜的各层置于70摄氏度的加热板上加热30分钟，以蒸发溶剂。然后用压敏胶带密封涂覆层朝向缓冲溶液的最外表面，留出一个小孔。

沿白色折线反复折叠XO Pad装置，使所有样本区域汇聚连接。用移液器将15微升微囊泡和外泌体样本加入汇聚的样本区域，静置数秒以确保完全润湿。在XO Pad两端各放置一个丙烯酸腔室，并用小型文件夹夹紧，防止其展开。

向腔室中加入 110 微升 0.1X PBS，并插入两个银电极。然后使用电流电压源测量系统，在电极上施加 30 伏电压，持续 20 分钟。为了分离富集的微囊泡和外泌体，将折叠的 XO 垫从丙烯酸腔室中取出，展开装置，以从其他层中分离出富集的颗粒。

在第八层和第九层中打孔取样，以获取富含微囊泡和外泌体的区域，用于后续分析。为优化操作时间以最大程度回收富集的颗粒，对荧光标记的微囊泡和外泌体进行了延时迁移实验。使用 ImageJ 软件对所有样品区域的荧光强度进行定量分析。

富集过程之前，微囊泡和外泌体在所有样品区域中呈分散分布，且荧光强度逐渐减弱。经过10分钟处理后，颗粒发生电动力迁移，并在第七层出现瞬时预浓缩区。当时间达到20分钟时，微囊泡和外泌体在第八层和第九层被显著富集，根据荧光强度计算，富集倍数达到五倍。

采用扫描电镜检测第八层中富集的微囊泡和外泌体的完整性。富集过程后观察到显著更多的未受损颗粒。同时分析了富集微囊泡和外泌体的粒径分布。

随后，分析了第六层、第八层和第十层样品区域中富集的微囊泡和外泌体的实际浓度。在第八层中，微囊泡和外泌体的预浓缩倍数达到5.58倍，但在其他层中未观察到明显的预浓缩效果。为确保该操作的可重复性，在装置验证和装置运行过程中，必须严格遵循烘箱孵育的时间和温度操作步骤，因为这些条件已经过优化。

通过使用碳酸盐缓冲液，XO Pad 还可用于从富含蛋白质的样本（如血清或血浆）中分离和纯化细胞外囊泡。该方案可提供一种高效、简便的制备工具，具备临床研究所需的预浓缩和分离能力，适用于诊断、药物递送、免疫治疗及其他治疗领域的研究。