改进的高通量DNA提取板加样方法可降低污染风险

本方案提供了一种提高96孔DNA提取板加样效率的同时降低样本交叉污染风险的技术。该技术通过将样本逐个加入96孔板的各个孔中，减少了DNA提取关键第一步过程中的污染机会。该方法可应用于微生物组研究的各个不同领域。

实验开始前，先用70%乙醇喷洒实验台表面。擦拭后，让实验台自然风干，再喷洒10%次氯酸钠溶液。再次擦拭并风干后，将显微镜镊子、刮勺和弯头手术剪浸入95%乙醇中，并用火焰灼烧工具进行灭菌。

然后将每种工具浸入10%次氯酸钠溶液中消毒，并让工具自然晾干。取样前，用乙醇对手套进行消毒，并充分均质化土壤样品。接着为每支试管分配带有井位信息的样品编号。

将95个已标记的2毫升离心管每管加入一个样品，直至每管约半满。第96个管用作提取空白对照。将分装好的样品管置于冰上，并根据96孔板的孔位标记，标记96个无菌的200微升平盖PCR管，然后按顺序将标记好的200微升PCR管放入96孔板架中。

为实验准备96孔板时，先将板盖取下并放入无菌塑料袋中。密封塑料袋以防止污染，然后用预先裁剪好的可穿刺封板膜覆盖96孔板。接着使用橡胶滚轮将封板膜牢固地压紧在板上，并将板置于4摄氏度条件下保存。

转移分样至孔板时，将24个2毫升分样管放入冰块中进行低温保存，并根据样本名称和孔位信息表选择相应的200微升平盖管。逐个涡旋振荡分样管，每管5秒，以确保样本均匀，然后将每个样本约200微升加入对应的PCR管中。当全部24个样本加样完毕后，用浸过漂白液的纸巾擦拭一根PCR管外壁，倒置并在实验台轻敲管底，使液体移至管顶。

使用经火焰灭菌并漂白过的剪刀剪去 PCR 管底部，以形成样品开口，将管子剪口朝上穿过孔板，直至到达目标孔位。轻轻倾斜孔板，以便刺穿预先切割的可穿刺密封膜；当管子位于正确孔位正上方时，迅速而小心地翻转孔板，使剪切的管尖插入孔中。使用无菌工具轻敲管子顶部，直至所有土壤从管中落入孔内。

将离心管放入孔中，并盖上盖子。当所有样品均以相同方式加样后，取出一个200 µL平盖PCR管，在样品孔中加入750 µL磁珠溶液。然后将该200 µL平盖PCR管重新放回孔中，并完全推入到底部。

使用记号笔在管子顶部做标记，以表明该孔已加样。当所有孔都加入磁珠后，将24个样品管放回20摄氏度保存，并将24个新的分样管放入冰块中，以便按照上述方法将下一组样品加入96孔板中。当95个孔均加入样品与磁珠混合液后，仅在第96个孔中加入磁珠溶液。

取出所有离心管，仅将离心管移至已覆盖的孔上方，并小心移除板上的可穿刺薄膜。然后，小心地将板盖从塑料袋转移至板上，并将板置于20摄氏度直至计划的提取步骤。不同板加载方法的比较表明，本演示方法在空白孔中产生的DNA浓度最低。

采用该方法时，DNA 浓度显著低于 McPherson 等人提出的方法。尽管该方法所得 DNA 浓度与 QIAGEN 默认方法之间无统计学差异。三种方法产生的平均 DNA 浓度均低于每微升 2 纳克。

尽管只有这种新方法能够产生无可测DNA浓度的孔。为尽量减少溢出的可能性，在将200微升离心管移至孔板上方时应保持其直立，倾斜孔板并将离心管插入正确的孔中。