利用声波纳米点样技术进行高通量DNA质粒多重化与转染

本视频中介绍的基于NanoDispenser的转染方案是首个用户友好的高通量转染方法，即使该领域的初学者也能成功操作。这种简便的高通量技术可实现细胞在384个独立条件下的转染。目前，由于所需试剂为纳升级体积，该方法成本较低。

为了确定所有细胞类型的最佳转染参数，我们建议保持源 DNA 浓度恒定，并使用不同量的转染 DNA、转染试剂以及不同数量的细胞。在分配 40 微升细胞悬液时，将 10 微升加样槽安装到蠕动泵液体处理装置上，并设置适当的程序。首先，将流速参数调至低速，以较低速度分配细胞，避免因剪切应力以及细胞对孔板底部的高冲击而可能造成细胞损伤。

然后，将分配高度调整至 11.43 毫米。该高度必须足够高，以降低分配过程中细胞对孔板底部的冲击，但又需足够低，以避免液滴滞留在分配针头上。接下来，将板的净空高度调整为 16 毫米，以便在每排分配完成后，分配针头可在板上方自由移动。

目视控制蠕动泵液体处理器头部高度的正确设置。确保在分配过程中分配尖端上无液滴残留。同时确认头部高度足够，以便在每排分配后能够移动头部。

为了生成用于驱动 ADE 分配的移液清单，开发了一款用户友好的电子表格宏，用于管理 DNA 用量，并在 384 孔板中混合最多四种质粒。电子表格中部分单元格已预填最佳体积，但也可进行修改。在粉红色区域，转染试剂或 TR 混合液的体积设定为 500 纳升。

源板孔中的最小体积值设置为4 µL，源板孔中的最大体积设置为11.25 µL。在对应于下方DNA的蓝色区域中输入起始DNA浓度为100 ng/µL。然后，在对应于该板384个孔的灰色和绿色区域中输入所需的DNA量。

输入质粒的用量和名称，并确保在多个孔中转染相同质粒时使用完全一致的拼写。点击“生成加样列表”以核对输入的数值，根据提示修正标为橙色的单元格，这些单元格表示存在错误或NanoDispenser无法处理的体积。若未检测到任何错误，宏将根据相应工作表中的数据生成384孔加样指南、DNA加样列表文件以及TR加样列表文件。

打印源板工作表中的模板，以在分配前直观显示需要填充的孔。质粒名称和最小填充体积已在图中标明。后续将填充到各孔中的转染试剂混合物体积以“TR”表示，并以绿色高亮显示。

为制备DNA来源板，使用蒸馏水将储存的DNA质粒稀释至每微升100纳克。接着，根据板的尺寸校准384孔网格。在平板电脑上打开384孔移液指南应用程序。

将源板放置在下屏的网格上。在左上角的校准菜单中，点击加号或减号以放大或缩小网格及孔位，使绿色孔位与板上的四个角孔对齐。使用双面胶带将3D打印的板适配器固定在屏幕上，以避免在分配过程中源板发生移动。

如有需要，使用旋转箭头以及上、下、右、左按钮移动已校准的网格，以调整网格与板的位置对齐。当网格和孔的尺寸已正确校准并定位后，勾选“锁定校准”复选框。点击“文件”并打开“384孔板移液指南”。

csv 文件。按照屏幕上的说明，将指定浓度的质粒手动分配到与预期板的正确目标位置相对应的白色高亮孔中。使用减号或加号箭头在DNA分配过程中向后或向前移动。

当加样至第一个需要加载的转染试剂溶液时停止加样。DNA加样完成后，从适配器上取下源板。如果需要填充多个源板，请将新的源板放置在适配器上，并按照加样说明进行操作。

离心装有DNA的源板，以确保液体表面平整，并去除可能导致ADE基础转移不准确的气泡。现在，运行检测程序以控制手动分配的体积。在NanoDispenser计算机上，启动NanoDispenser程序。

进入诊断选项卡，勾选源板复选框，将源板加载到板架上，然后勾选以录入该板。当系统提示时，选择 384LDV_AQ_B2 以将纳米分配器设置为水相缓冲液分配模式，然后按确定。在杂项菜单中选择扫描，然后单击启动。

选择预填充的孔进行分析，然后点击“开始”按钮。确认测量体积与预期体积一致，并确保没有孔的加样体积超过12微升。通过在新的无菌容器中加入10毫升预热的无血清培养基，并将管路整理器浸入其中，用无血清培养基预润管路。

按下蠕动泵液体处理仪的灌注按钮约10秒。通过目视检查分配头的液体流动情况，确保吸头未堵塞。将一个无菌的384孔细胞培养板放置在蠕动泵液体处理仪的板架上，并取下其盖子。

运行预校准程序，向384孔板的每个孔中加入一微升液体。分液时间约为八秒。然后盖上384孔板的盖子。

为了设置由 ADE 驱动的 DNA 分液，运行点样列表软件。将 384 个源孔设置为 384LDV。通过选择 384LDV_AQ_B2 将设备设为水相缓冲液分液模式。

并将目标板类型设置为 Greiner_384PS_781096。取消勾选优化转移通量。选择挑取列表选项卡。

单击导入，然后选择 DNA_Picklist_CSV 文件。接着，单击运行并保存该实验方案。

单击“模拟”以执行程序分配的模拟，确保移液清单与预期的实验设计一致。单击“运行”按钮并启动分配程序。当系统提示时，插入所需的源板。

然后将目标板放入NanoDispenser中。为设置转染试剂的分配，在生物安全柜中操作，将脂质多聚复合物转染试剂用无血清培养基稀释至一倍终浓度，并涡旋混匀试管。立即根据宏程序设计的源板布局，并使用预校准的384孔移液向导程序，分配TR混合液。

在完成TR分配后，需进行检测以控制所加载TR的体积，方法与之前检测加载的DNA体积相同。选择已预装转染反应混合液的孔进行分析，然后点击“开始”按钮。

确认测量体积与预期体积一致，并确保没有任何孔的加样体积超过 12 微升。现在，在挑取列表软件中重置 DNA 挑取列表。

确认设备参数仍设置为水相缓冲液。输入正确的源板和目的板类型。在移液列表选项卡中，单击“重置”以清除样本列表。

然后单击导入并选择 TR_Picklist.CSV 文件。单击播放。

如果系统提示，请保存该实验方案，然后单击“模拟”按钮，对程序中的转染试剂混合物分配进行模拟，以确保设计正确。与之前操作相同，在单击“运行”按钮并启动分配程序后，按提示先将源板、再将目标板放入NanoDispenser中。为分配细胞，需将制备好的细胞悬液加入一个新的无菌容器中，并持续搅拌，以避免细胞沉降导致分配不准确和细胞密度不均。

将试管架放入溶液中，然后按压引液按钮，直至细胞悬液开始从分配头流出。冲洗过程中，通过目视检查分配头的液体流动情况，确保喷嘴未堵塞，并确认每个试管中均已加入细胞悬液。

现在，将装有DNA和TR的384孔目标板放置在蠕动泵液体处理仪的板架上，并取下其盖子。运行预校准程序，将40 µL细胞悬液分配至整个384孔板。分配时间约为45秒。

最后，盖上384孔板的盖子。使用脂质聚合物复合物试剂转染HeLa细胞实验成功。在稀释液体积为1 µL时，DNA用量在5至30纳克范围内均表现出相同的转染效率，最高可达90%的细胞转染率。

相比之下，较高的用量导致转染细胞百分比急剧下降。测试了从15纳升到4微升不等的各种稀释液体积，确定1微升为最佳条件。为了进一步提高该方案的通量，测试了两种高效的DNA储存方法，即干存法和冷冻储存法。

两种储存方法与新鲜配制并储存不超过七天的DNA溶液相比，未产生显著差异的结果。由于质粒转染通常至少需要两种不同的质粒，因此在已确定的最佳条件下检测了本方案的DNA多重处理能力。先前使用的表达tdTomato红色荧光蛋白的质粒被改造为表达明亮的黄色荧光蛋白mVenus，并将两者用于共转染实验。

红色或绿色荧光阳性细胞分析显示转染效率约为80%。然而，如代表性软件图像分析所示，几乎所有红色细胞也同时共转染了表达mVenus的质粒。一旦DNA被分配至源板中，需进行检查以确保已加入预期体积的液体，且体积不超过12 µL。

在将转染试剂加入源板时，应尽量避免产生气泡，因为对子板进行离心会导致转染效率完全丧失。该方法可应用于生物学实验、法医学以及转染研究，适用于大多数可在384孔板中进行的实验。高效的转染为新的应用铺平了道路，例如基于质粒的、以CRISPR-Cas系统为基础的非筛选方法，可实现对目前在低效策略中无法分选的间歇性效应进行监测。