活细胞近同步激光扫描共聚焦与原子力显微镜联用技术（Conpokal）

Conpokal 结合了共聚焦显微镜与原子力显微镜，利用探针触碰样品表面。尽管这两种技术各自均有效，Conpokal 能够实现荧光共定位与力学表征的结合。该技术的主要优势在于近乎同步的双模显微成像。

共聚焦显微镜用于研究原子力显微镜（AFM）探针检测前后细胞骨架及其他细胞过程的变化，AFM可提供特定区域的力学特性。该技术在力学生物学领域具有重要意义，例如可在生理条件下对脑细胞进行探针检测，以研究电信号和力的传递。在开始分析之前，应选择适合所需数据采集的AFM悬臂梁，并佩戴手套，使用AFM芯片安装台、镊子和小螺丝刀将芯片安装到玻璃块中。

将原子力显微镜（AFM）芯片小心地放置在玻璃块的中心位置，悬臂及AFM芯片的一小部分应位于玻璃块的透明可视区域内。使用螺丝刀拧紧螺丝，直至芯片紧贴玻璃块，并使用放大镜检查芯片是否正确取向。

当芯片已正确取向后，将玻璃块以正确的方向放入原子力显微镜（AFM）探头中，并固定玻璃块。通过明场显微镜定位校准皿底部后，使用AFM系统的Z轴步进电机控制面板，将AFM悬臂移动至样品上方2000微米处。在明场照明下，通过Z轴步进电机控制面板，以100至200微米为步长，逐步缓慢降低AFM芯片，直至到达玻璃皿底部，以避免AFM针尖撞击培养皿。

在仪器平台上找到用于控制原子力显微镜（AFM）探头在X Y方向或平面运动的手动微调旋钮。当AFM悬臂的阴影变暗且轮廓变得更加清晰时，使用手动微调旋钮校正AFM探头，并调节AFM悬臂在视野中的位置。此时，可能需要调整查找表。

在显微镜软件视野中观察是否有阴影出现，这表明原子力显微镜（AFM）探针正在接近培养皿底部。继续以微小步进方式降低AFM探针，直至探针大部分处于聚焦状态。当激光就位后，使用激光对准旋钮将激光束对准悬臂上AFM探针所在位置的背面。

激光对准面板应显示大于零伏的总和信号。在原子力显微镜（AFM）悬臂上沿各个方向微调激光位置，直至在AFM针尖处获得最大总和信号。激光位置确定后，使用手动控制的偏转调节旋钮将垂直和侧向偏转归零。

使用垂直和横向偏转旋钮调整探测器，使目标居中，并且在激光对准面板中观察不到垂直或横向偏转。打开校准窗口，输入所有实验的特定信息。更换激光滤光片。

校准前，请关闭共聚焦显微镜的光源，并合上原子力显微镜（AFM）的屏蔽罩，以减少来自室内光线或振动的潜在噪声。按下“校准”按钮，系统将自动进行探针校准。校准完成后，悬臂的刚度及其灵敏度将显示在“校准”面板中。

然后使用自动进针命令按钮将探针降至样品皿底部，并设置皮肤区域大小、分辨率、设定点、Z轴扫描长度和像素时间，然后按下播放按钮开始扫描。对于显微镜软件中的共聚焦显微成像，需启用共聚焦功能，并选择与样品染色所用染料相匹配的激光谱线。选择一个或多个激光谱线以激发并成像样品中的相应结构，并调节增益值，使其在优化样品荧光信号的同时尽可能减少噪声。

调整激光功率，以避免像素饱和，同时最大化动态范围，并将针孔尺寸设为一个单位面积，以提高光学切片的分辨率。根据样本亮度，必要时调整上述参数。设置像素驻留时间时，起始值约为2微秒，然后根据样本亮度需要进行相应调整。

为所选物镜设置像素尺寸时，让仪器通过点击Nyquist选项按钮并结合图像中选定的像素数量来自动计算像素尺寸。接下来，选择扫描选项并开始数据采集。使用聚焦旋钮找到能最清晰呈现样品特征的焦平面，点击扫描按钮开始采集数据，再点击捕获按钮获取一幅二维图像。

使用通过Nyquist选项控制像素大小的面板，将扫描区域缩小至仅包含单个细胞。激活采集工具，采用从下到上的扫描方式，仅使用能最清晰照亮样品中目标结构的激光线，根据建议的层间间距设置待测量体积的起始和终止层面。为文件命名并保存至相应文件夹。

或者，如果已知样品的厚度，可通过调节焦距选择最亮、最清晰的中间层面以确定成像体积，将顶部设为中间层面以上等于样品厚度的位置，底部设为中间层面以下等于样品厚度的位置，然后选择合适的步进大小。点击“立即运行”按钮开始采集。采集完成后，将文件保存至相应文件夹。

实验结束时，戴上手套取下玻璃块，并将其放入安装台。使用带橡胶 grip 的镊子小心取下原子力显微镜（AFM）芯片，并将已使用的探针 tip 放回储存盒中指定的位置，且方向应朝外以表明该探针已被使用。为便于后续参考，请记录本次实验所使用的探针编号。

此处展示了一个在活体HEK细胞上进行的代表性原子力显微镜（AFM）扫描图像。该HEK细胞的高度约为10微米，通过线扫描结果得以证实。此处还可观察到由于AFM探针选择不当而导致的一次质量较差的扫描示例。

在此图像中，细胞顶端出现了黑色像素，表明由于细胞高度较大，原子力显微镜（AFM）的压力敏感区域已超出范围。此外，由于探针偏移以及探针高度相对于细胞高度不足，AFM悬臂的末端也出现在图像中。这些AFM图像中的伪影表明，应选择另一种AFM探针来对细胞成像。

可以进行三色共聚焦成像。例如，用于观察细胞核、微管和脂质膜。结合纳米力学模型对针尖压痕进行分析，可生成表面的模量图谱。

此处展示了激光共聚焦Z轴序列图像对应的三维投影。对于微生物，也可获取原子力显微镜（AFM）扫描图像及测量得到的模量图，如本图中变形链球菌细菌的代表性分析所示。如图所示，在此尺度下，AFM所能达到的分辨率优于传统的共聚焦显微镜。

黏附力图谱是一种通过共聚焦技术实现的可视化分子相互作用的方法。例如，可用于研究细胞表面分子的调控，以观察其结合动力学。共聚焦技术为探索医学微生物学中结构与功能关系提供了新的途径。

例如，物理和化学事件以及肽聚糖层可能与抗生素耐药性相关联。