超分辨率成像与共享管理：一种用于多通道检测共聚焦显微镜的实验方案

我们的研究致力于开发可及的超分辨率成像方法，以可视化动态的亚细胞结构，突破传统显微镜的衍射极限。超分辨率方法面临光毒性、操作复杂以及需要特殊制备等问题。本方案通过基于共聚焦的多重检测技术，降低了这些技术门槛。

首先，打开显微镜主机、激光发射模块、LED 光源和控制计算机的电源。启动显微镜操作软件。在主界面中选择 GFP，然后关闭反射光。

进入采集面板。从物镜下拉菜单中选择合适的物镜。进行活细胞成像时，应在成像前45至60分钟启动环境培养箱和主动聚焦稳定系统。

系统稳定后，使用培养箱传感器验证其稳定性。在物镜前端透镜上滴加浸油，注意避免产生气泡。将制备好的样品放置在显微镜载物台上。

小心地抬起，直到盖玻片接触到浸油。接下来，打开采集软件。进入“采集”选项卡，选择创建新实验。

现在，为所用的荧光染料添加成像通道。对于每个通道，将共聚焦针孔直径设置为一个空气单位。为优化激光功率，选择第一个通道并切换至实时扫描模式。

将初始激光功率设为较低值，然后将检测器增益调节至其线性范围内的中等水平。随后逐步增加激光功率，直至目标结构在实时图像中清晰可见，且明显高于背景信号。使用软件中的奈奎斯特采样按钮设置像素尺寸，以自动计算最佳值。

接下来，设置像素时间。然后选择轨道间的逐帧扫描模式，以尽量减少串扰。单击“拍摄”以获取单幅图像。

保存带有相关元数据的图像。为了在光学切片间保持设置的一致性，在定义Z轴扫描范围之前，需确认所有成像参数已在单一最佳焦平面上进行配置。打开采集选项卡，选择Z轴扫描模式。

通过快速实时扫描来定义感兴趣区域的体积：首先聚焦到最底部的感兴趣结构，然后点击“设置末层”或“底部”。仔细调节焦距至最顶部的感兴趣结构，然后点击“设置首层”或“顶部”。软件将显示总深度。

设置Z轴步进尺寸以满足奈奎斯特采样标准。可使用“最优”按钮自动计算该值。在为每个通道配置成像参数后，与单幅二维图像相比，对于较弱信号可略微增加激光功率或增益。

开始采集以获取完整的图像序列。为便于观察，使用显微镜自带的图像处理模块，生成最大强度投影图，以在单个二维图像中显示所有聚焦的信号。

然后使用软件内置的算法进行体积渲染，以生成三维图像。根据需要调整亮度、不透明度和光照。随后生成正交的XZ和YZ截面，以检查轴向范围和配准情况。

对固定的COS-7细胞进行多色荧光成像显示，细胞核、线粒体和微管被清晰标记，且重叠信号极少，证实了有效的顺序扫描与优化的检测效果。最大强度投影整合了所有光学切片中的信号，突出了荧光标记结构的空间分布。三维重建则提供了对样品结构深度信息的可视化观察。

通过对不同成像模式下带有EGFP标记线粒体的活体Hep 3B细胞进行延时成像，进行比较。共聚焦显微镜在不同时间点采集的图像显示出清晰的结构，但荧光信号随时间逐渐减弱。标准超分辨率（SR）成像虽具有更高的分辨率，但随时间推移光漂白现象更为明显。

快速超分辨率或SR-4Y图像即使在较晚的时间点也能保持稳定的荧光信号。EGFP平均荧光强度在100个时间点上的变化曲线显示，SR-4Y模式维持了最稳定的信号。在固定COS-7细胞中的成像性能比较表明，超分辨率模式比共聚焦模式提供了更清晰的结构细节。

使用100纳米荧光微球测量点扩散函数表明，与单独使用Airyscan超分辨成像相比，Airyscan超分辨成像结合联合去卷积处理可同时提高横向和轴向分辨率。本实验方案使研究人员能够在约120纳米分辨率下研究固定细胞和活细胞中的细胞器形态、细胞骨架动态以及分子共定位。本方案最关键的考虑因素是精细的样品制备，需使用高质量的盖玻片和优化的染色方法，以确保超分辨成像处理所需的信号完整性。

通过该步骤，研究人员可使用 ImageJ 等专用软件进行定量图像分析，例如测量信噪比或共定位。