使用环介导等温扩增法检测灌溉水中的Phytophthora capsici

植物病原体检测是植物病害管理中的关键步骤。本方案提供了一种针对常见水传疫霉病原体引起的灌溉水污染的快速检测方法。利用该技术，可对大量灌溉水中的特定病原体（如辣椒疫霉，Phytophthora capsici）进行现场处理并快速检测。

演示该实验操作的是来自我实验室的硕士研究生 Owen Hudson，以及来自 Dr. Pingxi G 实验室的博士后研究人员 Sumyya Waliullah，他们将共同搭建一套泵滤装置，用于在现场检测灌溉水中的辣椒疫霉（Phytophthora capsici）。将一个抽滤瓶通过导管连接至手动抽气泵，并将布氏漏斗插入抽滤瓶口的橡胶塞中。然后，在漏斗中放入一张合适尺寸、孔径为 15 微米（15 µm）的滤纸。

为获取水样，需从目标水源采集灌溉用水。水样可能含有少量碎屑，但不应有大量沉淀物或土壤。使用手动泵产生吸力，使水通过漏斗的同时，缓慢将50至1000毫升的待测水样倒入漏斗内的滤纸中。

当所有水样过滤完毕后，使用镊子将滤纸从漏斗中取出，并用无菌剪刀将滤纸剪成小片。取8至12片滤纸碎片，放入含有400微升提取缓冲液的1.5毫升离心管中，在室温下孵育5分钟。

每分钟一次，每次用漩涡振荡器或其他方式剧烈振荡纸片10秒。孵育结束后，用镊子将纸片取出，尽量减少缓冲液的带出。然后用下一组滤纸片重复该步骤。

从滤纸样本中提取DNA时，向样本中加入20微升蛋白酶K和10微升浓度为每微升10纳克的RNase，混匀后于室温孵育15分钟，每隔3分钟涡旋振荡或摇动一次。孵育结束后，向样本中加入500微升结合缓冲液中的磁珠，通过振荡充分混匀。室温静置5分钟后，将离心管置于磁力架上静置2分钟，随后移除并弃去上清液。

将离心管从磁力架上取下，加入500 µL洗涤缓冲液，剧烈重悬磁珠。30秒后将离心管放回磁力架，静置2分钟，弃去上清液。再用500 µL洗涤缓冲液和500 µL 80%乙醇按相同方法重复洗涤一次。

室温下以空气驱动磁珠沉淀15分钟。孵育结束后，用移液器将磁珠重悬于50 µL洗脱缓冲液中1分钟，然后将离心管重新置于磁力架上静置2分钟，以收集上清液。按照表格所示配制LAMP引物混合液后，向PCR管中加入2.5 µL引物混合液、12.5 µL Lava LAMP预混液、1 µL提取的DNA以及9 µL双蒸水，并设置一个阳性对照和一个阴性对照。

将所有样品置于64摄氏度的恒温水浴中孵育45分钟，或使用Genie III扩增仪进行孵育。孵育结束后，取5 µL每种扩增后的样品上样至1%琼脂糖凝胶，利用紫外成像仪观察产生的条带。如果使用了比色染料，则通过观察颜色变化来判断结果为阳性或阴性。如果使用了便携式扩增仪器，则通过观察屏幕上的扩增曲线来判断结果。

LAMP检测在64摄氏度下的运行光学时间为45分钟，因为最低浓度的阳性检出样本直到40分钟才开始扩增，而较高浓度样本在20分钟时即已扩增。扩增结果可通过含核酸染料的1%琼脂糖凝胶电泳确认。如图所示，常规PCR的灵敏度比LAMP低40倍。

最低检测到每毫升 4.8 × 10³ 个游动孢子的浓度。在本项分析中，水样采自佐治亚州蒂夫特县用于商业蔬菜生产的七个池塘，其中三个池塘的 LAMP 检测结果呈阳性。

然而，当使用常规PCR检测样本时，仅在三个阳性样本中的一个检测到游动孢子。本表总结了不同检测方法在灵敏度、耗时、所需制备步骤、材料和成本等方面的差异。在所测试的方法中，LAMP是成本最低的方法，同时也是最快的，其扩增仅需30至60分钟，而常规PCR扩增所需时间更长。

采用本方案，从密切相关的UMI种子病原体中提取的DNA对所有样本均无检测信号，证实了引物的特异性。过滤样品水时切勿倾倒过快，在将提取的DNA加入LAMP管时需小心操作，以尽量减少污染。一旦其他水传病原体的特异性引物组开发完成，该过滤与LAMP检测方法即可适用于其他病原体的检测。