一种在单细胞水平研究形状依赖性转录组学的方法

我们提出了一种研究细胞形态对基因表达影响的新平台，该方法可在单细胞水平上培养并分选具有不同形态的贴壁细胞。该技术的主要优势在于，它能够实现细胞形态的高通量体外研究，而相比之下，在体内比较具有不同形态的细胞在技术上具有较高难度。为了建立图案化的心肌细胞培养体系，需将具有目标长宽比的心肌细胞悬液转移至15毫升离心管中进行计数，并用适当的铺板培养基将细胞稀释至浓度为1×10⁵个细胞/毫升。

将两毫升细胞加入一个35毫升的Grenier培养皿中，该培养皿内含有两毫升预热的铺板培养基，并已放入经纤维连接蛋白包被的微图形芯片，随后将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育18小时。次日，通过光学显微镜检查芯片，确认大部分细胞已贴壁。从培养皿中移除培养基以去除碎片或死细胞，然后从中心开始向四周逐滴轻轻加入PBS。

第三次洗涤后，将 PBS 替换为 4 毫升维持培养基，并将细胞放回细胞培养孵育箱中。72 小时后，按照所示方法，每次用 2 毫升预热的 Dulbecco's PBS 轻柔冲洗芯片表面两次，并用镊子立即将洗涤后的芯片转移至新的无菌 35 毫升 Grenier 培养皿中。迅速向芯片中加入 1.5 微升用 DPBS 稀释 1000 倍的 Vibrant Dicyle Green 染料。

在芯片上固定腔室，并将培养皿放置于细胞挑选仪载物台的皿托上。插入磁性盖帽，在实时成像窗口中定位十字准线。聚焦于十字准线，并在扫描与分选窗口中选择自动注射校准模式并进行校准。

将培养皿中的上清液替换为1.5毫升按1:1比例配制的三重E溶液（溶于DPBS中），以使细胞从纤维连接蛋白上脱落，并打开扫描选项卡。为扫描整个芯片，先将视野对准芯片的左上角，点击“获取当前显微镜位置”；随后将焦点移至芯片的右下角，再次点击“获取当前显微镜位置”。

在弹出窗口中，单击设置最清晰焦平面，然后单击右上角和左下角的定位按钮。接着，单击完成以开始扫描。扫描完成后，打开分析选项卡，单击显示图谱以选择符合研究标准的单个细胞。

将玻璃微毛细管置于显微镜实时视野中央，并打开泵控制选项卡。为产生真空，从一支50毫升1号注射器中回抽活塞4毫升，并打开分选选项卡。为允许捕获单个细胞，设置阀2开启120毫秒，阀1在延迟200毫秒后开启20毫秒。

为了确保所挑选的细胞能够成功递送至含有裂解缓冲液的PCR管中，将阀一设置为开启20毫秒，阀二在延时10毫秒后开启10毫秒。调整好阀门设置后，点击“计算路径”。软件将计算出在芯片上逐个拾取并注射所选细胞的最快路径。

然后，将显微镜对焦于芯片表面的某一图案。使用操纵杆小心地移动微毛细管，使其尖端在不接触芯片表面的前提下呈现最清晰的图像，随后点击“set”。此时将打开一个新窗口，显示微毛细管的横截面图像。

为使软件记录毛细管在 X、Y 和 Z 坐标中的尖端偏移量，请点击毛细管的正中心。然后点击“开始分选”以启动分选过程。在此对挑取的单个细胞来源的预扩增 cDNA 的代表性分析中，凝胶样密度图中观察到一条清晰条带，对应于电泳图中 1,852 个碱基对处的峰。

片段的平均长度为1,588个碱基对，仅有少量片段短于300个碱基对，表明成功构建了高质量的cDNA文库。还可通过免疫荧光染色与分析来评估图案化心肌细胞内的肌节结构。该平台为不同类型心力衰竭的高通量研究和药物筛选奠定了基础。