一种非编码小RNA MicC在膜外蛋白的毒力中发挥作用 沙门氏菌 Enteritidis

该方案可用于失活染色体基因，以分离突变体用于基因功能及细菌研究。该方法使同源重组过程变得简单、快速且高效。利用此技术，可删除病原菌中与毒力相关的基因，获得减毒突变体，作为减毒疫苗的候选株。

首先扩增含有 micC 基因血源性片段的氯霉素抗性盒。设计上下游引物，以质粒 PKD3 为模板扩增氯霉素抗性盒，引物应包含 micC 基因 5' 端和 3' 端各 50 个碱基的同源延伸序列。按照文本稿件中所述方法进行 PCR，以 PKD3 质粒为模板扩增氯霉素抗性盒。

通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物的大小。然后使用DNA凝胶回收试剂盒纯化产物，并通过分光光度法测定DNA的浓度。进行第二次PCR反应，以消除PKD3质粒进一步重组可能带来的干扰。

将第一轮PCR产物按1比200的比例稀释，并用作第二轮PCR的模板。为构建第一个重组菌株50336 delta micC dot cat，将100 µL SE 50336感受态细胞与5 µL PKD 46质粒混合，在冰上孵育30分钟。在42 °C下热激90秒，然后迅速转移回冰上冷却2分钟，以将质粒转化入细胞中。

在含有氨苄青霉素的平板上将细胞于30摄氏度培养过夜，筛选呈阳性的菌落。次日，在SE 50336 PKD 46液体培养物中加入30毫升L-阿拉伯糖，并在30摄氏度下振荡孵育1小时，以诱导重组酶的表达。将100纳克纯化的PCR产物与40微升SE 50336 PKD 46感受态细胞混合于电击杯中。

然后进行电击转化。电转化后，将混合物转移至1 mL SOC培养基中，在30°C、150 rpm条件下于摇床培养箱中培养1小时。将混合物涂布于含氯霉素的LB平板上，37°C过夜培养，以筛选阳性菌落。

将阳性菌落在 42 摄氏度下培养两小时。然后在 37 摄氏度下过夜筛选菌落对氨苄青霉素的敏感性及对氯霉素的抗性，以获得首个不含 PKD46 的重组菌株。使用 PCR 和琼脂糖凝胶电泳提取 50336 ΔmicC·cat 基因组 DNA 后，将 100 纳克质粒 PCP20 电转化至 40 微升 50336 ΔmicC·cat 感受态细胞中。

在30摄氏度下，于含有氨苄青霉素和氯霉素的抗性平板上筛选阳性转化子。将阳性转化子转移至无抗性的LB液体培养基中，于42摄氏度过夜培养。随后在37摄氏度的LB平板上分离单菌落。

选择对氨苄青霉素和氯霉素均敏感的菌落。该突变体为 micC 缺失突变体 SE 50336 ΔmicC。按照文稿中所述方法进行 PCR 验证 50336 ΔmicC。

本实验方案用于在互补突变株 50336 Delta micC, pmicC 中构建缺失突变株 50336 Delta micC。通过 PCR 验证第一个重组子 50336 Delta micC dot cat，预期扩增产物条带大小约为 1200 个碱基对（含氯霉素插入片段），而野生型菌株的扩增产物为 279 个碱基对。在第二次重组过程中，利用 PCP 20 消除了氯霉素抗性盒。

PCR 结果结合测序分析证实，已成功构建同基因型的 micC 突变株。通过实时定量 PCR 分析了菌株 50336、50336 ΔmicC 和 50336 ΔmicC pmicC 中 ompA、ompC 和 ompD 基因的表达水平。与野生型菌株相比，50336 ΔmicC 中 ompA 和 ompC 的转录水平分别增加了约 2.2 倍和 3 倍。

尽管ompD的转录水平仅略有增加。LD50实验显示，在用三种菌株分别感染6至8周龄的BALB/c小鼠后，大多数感染50336 ΔmicC菌株的小鼠在感染后48小时出现精神萎靡、食欲减退或腹泻等症状，并在96小时后死亡。而感染野生型菌株和50336 ΔmicC pmicC菌株的小鼠则在感染后72小时出现相同症状，并在120小时后死亡。

三种菌株的LD50结果表明，与野生型相比，突变株50336 Delta micC的毒力增强了2.5倍。该技术有助于研究人员研究细菌基因的功能，并通过删除目标基因获得所需的工程菌株。