基于无标记定量蛋白质组学的工作流程用于发现驱动型宿主-病原体相互作用
2020年10月20日
本文介绍了一种基于质谱蛋白质组学的方法，用于在感染过程中分析宿主与病原体之间的相互作用。该方法通过非标记定量技术，在单次实验中同时检测宿主（例如巨噬细胞）和病原体（例如Cryptococcus neoformans）蛋白质丰度的变化。
本方案从宿主和病原体两个角度研究真菌感染，以鉴定对疾病发生至关重要的生物系统间相互作用。我们可在单次实验中同时检测真菌和宿主的蛋白质，并识别仅在感染过程中表达的真菌蛋白，这些蛋白代表了新的与感染相关的蛋白。尽管我们的研究重点是通过揭示新型抗毒力策略来治疗真菌感染，但所采用的蛋白质组学与生物信息学分析流程具有普适性，可应用于多种生物系统。
我们的方法为研究不同病原体及多种免疫反应奠定了基础，可用于深入揭示隐球菌与先天免疫系统之间的关系。巨噬细胞对病原体的反应以及检测到足够的真菌蛋白至关重要。因此，建议针对每种物种测试并优化感染复数（MOI）和时间点。
由于巨噬细胞和真菌细胞培养可能具有挑战性，了解共培养后可能出现的情况非常重要。可视化结果可帮助研究人员更有信心地实施该实验操作。为准备用于巨噬细胞感染的真菌细胞，需从处于对数中期的培养物中收集并离心 C. neoformans 细胞，随后在相同的离心条件下，用 1 毫升室温 PBS 轻柔洗涤三次。
最后一次洗涤后，将真菌细胞重悬于无抗生素的细胞培养基中，浓度为每毫升 1.2 × 10⁸ 个细胞，并向六孔巨噬细胞培养板中每个含 70% 至 80% 汇合度的孔加入 1 毫升真菌细胞悬液。然后，将培养板放入细胞培养箱中孵育 3 小时。小心倾斜培养板，使每个孔用 1 毫升 PBS 轻柔地洗涤 3 次，每次洗涤每孔使用 1 毫升 PBS。
为测定最后一次洗涤后的感染效率，向六孔板的每个孔中加入一毫升不含抗生素的培养基，并将该板放入细胞培养箱中。在适当的实验时间点，收集每个孔中的上清液，并根据标准方案测定各孔中乳酸脱氢酶（LDH）的含量。在同一时间点，裂解未感染的巨噬细胞，以确定最大细胞毒性值。
随后可使用所示公式计算细胞毒性。对于未感染的巨噬细胞收集与共培养，向每孔未感染的巨噬细胞中加入一毫升冷PBS。一分钟后，轻轻敲击培养板，使细胞从孔底脱落，并将细胞悬液汇集至一个15毫升离心管中。
通过离心收集细胞，并彻底去除上清液，以便将沉淀物立即在液氮中快速冷冻，随后于-80°C保存。对实验流程的数据集进行主成分分析表明，与预期一致，数据中最大分离组分是感染样本与非感染样本之间的差异。样本的第二个区分特征是其生物学变异性。
通过欧氏距离进行层次聚类并结合皮尔逊相关性分析，可明显区分感染样本与非感染样本，其重复样本的可重复性范围为95%至96%。可采用经Benjamini-Hochberg错误发现率校正的Student's t检验，以鉴定感染组与非感染对照组之间丰度存在显著差异的蛋白质。在此分析中，共鉴定出117种在感染后表达水平发生显著变化的宿主蛋白质。值得注意的是，如预期所示，感染期间真菌蛋白质的丰度也显著增加。
在共培养、洗涤和样品收集过程中，轻柔处理巨噬细胞至关重要。通过明确病原体如何适应宿主以及宿主如何抵御感染，微生物学和免疫学领域获得了新的认识。
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概述
本方案利用基于质谱的蛋白质组学技术，研究真菌感染过程中宿主与病原体之间的相互作用。该方法可在单次实验中同时检测宿主和病原体的蛋白质，从而揭示与感染相关的蛋白质特征。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 传染病
- 蛋白质组学
背景
- 了解宿主与病原体之间的相互作用对于疾病研究至关重要。
- 真菌感染构成重大健康风险，亟需开发新的治疗策略。
- 蛋白质组学可揭示感染过程中蛋白质丰度的变化。
- 巨噬细胞在机体对病原体的免疫应答中发挥关键作用。
研究目的
- 分析宿主巨噬细胞与病原真菌新型隐球菌之间的相互作用。
- 鉴定真菌感染过程中产生的新型感染相关蛋白。
- 建立一种可应用于多种生物系统的通用蛋白质组学与生物信息学分析流程。
使用方法
- 基于质谱的蛋白质组学用于蛋白质检测。
- 采用无标记定量法测量蛋白质丰度变化。
- 优化感染复数（MOI）和时间点以获得准确结果。
- 生物信息学分析以解读蛋白质组学数据。
主要结果
- 鉴定在感染过程中特异性产生的真菌蛋白。
- 深入了解巨噬细胞对新型隐球菌的免疫应答。
- 建立用于研究多种病原体及免疫反应的分析框架。
- 展示该实验方案在不同生物系统中的适用性。
结论
- 该方案为研究宿主-病原体相互作用提供了一种全面的方法。
- 它为未来关于真菌感染和免疫反应的研究奠定了基础。
- 建议针对不同物种进一步优化实验条件。
常见问题
行业应用价值
这种无标记定量蛋白质组学工作流程能够在感染过程中同时分析宿主和病原体的蛋白质组，提供无偏倚的蛋白质丰度数据，这对于传染病研究中的靶点验证至关重要。通过鉴定与感染相关的真菌蛋白质和宿主应答特征，该方法支持抗毒力策略的机制性风险评估，并为临床前靶点选择提供依据。该方法在不同宿主-病原体系统间的可转移性，增强了其在抗真菌和免疫调节药物发现项目中的广泛适用性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过鉴定感染期间特异性表达的病原体蛋白，揭示全新的与毒力相关的治疗靶点，从而推动治疗假设的验证。
- 科学价值：通过宿主与病原体双方面的蛋白质组丰度变化关联分析，阐明宿主-病原体相互作用通路，支持功能靶点的验证。
- 科学价值：提供定量、可重复的感染状态下蛋白质组学谱型，减少机制上的不确定性，有助于降低靶点假设的风险。
筛选与检测方法开发
- 操作价值：通过标准化感染条件和感染复数（MOI）优化，为后续检测方法开发制备经过验证的生物系统（感染的巨噬细胞）。
- 操作价值：生成定量、无标记的蛋白质组学数据，适用于筛选项目中的检测标准化和可重复性评估。
- 操作价值：由于采用了通用的蛋白质组学和生物信息学分析流程，该平台可扩展并重复用于多种不同病原体的研究。
转化与临床前研究
- 转化价值：鉴定在微生物入侵时发生响应的与疾病相关的宿主蛋白，从而实现生物标志物的匹配，用于临床前验证。
- 转化价值：通过将感染状态下的蛋白质组变化与致病机制相联系，确保从发现到临床前研究的连续性。
- 转化价值：通过揭示对毒力及宿主防御机制至关重要的蛋白，为风险调整后的研发推进决策提供依据。
流程与工作流整合
该工作流程通过宿主-病原体相互作用分析整合到早期发现生物学中，利用标准化感染模型支持筛选准备工作，并通过将蛋白质组变化与毒力及免疫应答机制相连接，推动转化医学研究。
- 发现生物学：通过量化病原体和宿主蛋白质组在感染后的变化，支持假设验证和通路解析。
- 筛选：提供即用型生物系统，并优化感染复数（MOI）和时间点，确保建立可重复的感染模型用于化合物评价。
- 分析：提供无标记定量检测和统计分析结果（例如经Benjamini-Hochberg校正的t检验），用于比较不同条件并鉴定显著改变的蛋白质。
- 转化研究：将蛋白质组学特征与致病机制及宿主防御反应相关联，支持生物标志物发现和临床前研究的连续性。
- 企业级复用：建立可重复使用的蛋白质组学与生物信息学分析流程，适用于多种病原体和免疫系统，减少重复的方法开发工作。
运营与企业影响
- 科学价值：通过无偏倚、定量的感染状态蛋白质组学分析，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过优化的共培养、洗涤和裂解方案，结合经过验证的质量控制指标（PCA、聚类分析、95–96% 的重复重现性），增强实验的可重复性和标准化水平。
- 战略价值：揭示关键毒力因子和宿主应答网络，改善“推进/终止”决策，降低抗真菌项目在后期阶段的生物学风险。
- 项目组合影响：基于感染特异性蛋白表达及通路参与情况，实现对靶点的风险校准优先排序。
实施注意事项
- 需要具备哺乳动物和真菌细胞培养、蛋白质组学样品制备以及质谱数据分析方面的专业知识。
- 依赖于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）仪器、非标记定量分析软件，以及用于主成分分析（PCA）、聚类分析和差异表达分析的生物信息学工具。
- 需要跨团队对感染参数（如感染复数MOI、时间点）和样品处理流程进行标准化，以确保研究间的可重复性。
- 针对不同的病原体-宿主系统需进行适应性调整，包括真菌细胞制备和巨噬细胞汇合度的优化。
- 实际限制因素包括在高背景宿主信号中检测低丰度真菌蛋白的技术挑战，这要求足够的感染深度和检测灵敏度。
