利用多聚核糖体分析法研究小鼠发育大脑中的翻译过程

转录调控在大脑发育过程中发挥着重要作用。多聚核糖体分析提供了一种有用且强大的工具，用于评估 mRNA 的翻译状态，从而能够研究大脑发育过程中翻译调控的功能。该方法是一种简便且低成本的制备蔗糖梯度并分析多聚核糖体分级组分的技术。

在本实验方案中，该方法用于分析发育中的小鼠大脑皮层。然而，它也可轻松地适用于研究其他系统。首先将2.2摩尔的蔗糖稀释，制备六份10%至50%的蔗糖梯度溶液。

用一个30毫升注射器吸取约16毫升10%蔗糖溶液，将其安装在注射泵上，并连接至针头。确保注射器、管路和针头中无任何气泡，并用擦拭纸擦去针尖处的残留液体。移动电动载物台，使针尖接触底部管壁的中心位置。

将注射泵设置为流速每分钟2毫升，体积为2.3毫升。在加入2.3毫升10%蔗糖溶液后，下调电动载物台，并对全部六个梯度重复此过程。随后将20%蔗糖溶液加至管底，接着依次加入30%、40%和50%的溶液。在胚胎发育第12天收集CD1小鼠胚胎，并将其置于含有冰冻HBSS的10厘米培养皿中，置于冰上。

在解剖镜下，将一个胚胎转移至含有冰冷 HBSS 的 6 厘米培养皿中。使用 21 至 23 号针头以 45 度角穿刺眼睛，固定头部位置，并施加力量确保针头牢固固定在培养皿上。用 5 号镊子从中线向两侧剥离皮肤和颅骨，随后切断嗅球并去除脑膜，以暴露皮层组织。

使用弯头镊子将皮层组织剪碎，并放入冰上盛有 2 至 3 毫升神经基础培养基的容器中。根据需要，可分别取自不同胚胎的组织。通常 8 至 10 个胚胎的组织可获得约 200 微克总 RNA。

将环己酰亚胺加入含有已解剖组织的神经基础培养基中，使其终浓度为 100 微克/毫升，并在 37 摄氏度孵育 10 分钟。在 4 摄氏度下以 500 × g 离心组织 5 分钟，弃去上清液。用预冷的 PBS 缓冲液（含 100 微克/毫升环己酰亚胺）洗涤组织两次。

加入500微升细胞裂解缓冲液，其中添加4微升RNase抑制剂，用移液器吹打混匀以重悬组织。使用胰岛素针头轻轻裂解组织。然后将样品置于冰上孵育10分钟，每隔两到三分钟短暂涡旋振荡一次。

孵育后，在 4 °C 条件下以 2000 × g 离心 5 分钟，将上清液转移至预冷的新离心管中。重复此步骤一次，离心条件为 13,000 × g。将上清液转移至预冷的新离心管后，使用紫外-可见分光光度计测定组织裂解液中的 RNA 浓度。

将裂解液缓慢加样至超速离心管管壁，使样品加载到蔗糖梯度溶液的上方。将蔗糖梯度管轻轻放入转子套管中，并在190,000 × g、4°C条件下超速离心90分钟。将一支空的超速离心管置于穿刺架上，从底部用针头轻轻刺穿离心管。

用一个30毫升注射器吸取25毫升60%蔗糖追赶溶液。然后轻轻推动注射器，使追赶溶液充满空管并流经254纳米紫外检测器，以设定检测基线。按下紫外检测器上的自动调零按钮以记录检测基线，然后点击软件上的播放按钮开始记录。

系统建立基线后，暂停软件上的记录，并撤回追加溶液，确保系统中无残留的追加溶液。将一个样品管装入穿管针座，从底部轻轻用针头刺穿样品管。开始软件记录，确保管路中无气泡。

然后启动注射泵和组分收集器，以收集多聚核糖体组分，将组分收集器设置为每30秒收集一管。将各组分收集至1.5毫升离心管中。来自八个胚胎皮层裂解液的RNA样品经蔗糖梯度离心后被分离为12个组分。

在254纳米波长处的紫外吸收峰可识别出含有40S亚基、60S亚基、80S单体核糖体及多聚核糖体的组分。通过Western blot检测大核糖体亚基Rpl10发现，该蛋白存在于60S亚基、单体核糖体及多聚核糖体中。相比之下，细胞质蛋白Gapdh和Csde1不与核糖体结合，而在含有游离RNA的组分中富集。

与不同组分中蛋白质的分离结果一致，Gapdh 和 sox2 mRNA 在富含重多聚核糖体的组分中显著富集，表明这些 mRNA 在发育中的大脑皮层中能够被高效翻译。相比之下，rpl7 和 rpl35 mRNA 则在含有单核糖体的组分中富集，提示其翻译受到抑制。为了获得可重复的实验结果，制备蔗糖梯度时保持操作的一致性至关重要。

应使用注射泵来推出蔗糖。在进行梯度分离和样品收集过程中，需用无RNase的水清洗系统，以减少前一个样品残留的任何蔗糖。

该方法可用于评估各种组织中 mRNA 的翻译状态。利用该平台可获得稳定的多聚核糖体分析梯度，为这一经典且有用的技术提供了一种低成本的解决方案。