利用原子力显微镜观察脑组织多聚核糖体

本实验方案的总体目标是提供一个详细的流程，用于在云母表面精确纯化和沉积脑组织多聚核糖体，并在无需大量后期处理或三维重构分析的情况下，获得数千张纳米级分辨率的图像。该方法有助于回答翻译及翻译调控领域的关键科学问题，例如理解基因表达重编程过程中多聚核糖体内部核糖体排列对功能的影响。该技术的主要优势在于无需对样品进行固定或标记，且可在接近生理条件下进行检测，从而能够轻松识别核糖体和裸露的RNA链。

尽管该方法可揭示哺乳动物多聚核糖体的结构，也可应用于其他微生物（如酵母、细菌和昆虫）以及涉及基因表达翻译调控状态的研究。该方法的可视化演示至关重要，因为多聚核糖体样品在云母吸附及洗涤步骤中的操作较为复杂，需要熟练的技术和经验。本实验操作将由 Paola Bernabo 和 Lorenzo Lunelli 进行演示。

首先，按照随附的文字实验方案收集并冷冻脑组织。然后，将冷冻的组织从冰箱中取出并置于实验台上。将冷冻的脑组织和液氮放入预冷的研钵中，用研杵研磨至形成粉末状。

取约25毫克脑组织粉末转移至预冷的微量离心管中，并立即加入0.8毫升裂解缓冲液。用移液器快速吹打混合液25次，以充分裂解细胞。随后，在4°C条件下以12,000 × g离心1分钟，使细胞碎片沉淀。

将上清液转移至新的微量离心管中，冰上放置15分钟。然后离心5分钟，以沉淀细胞核和线粒体。接着，小心地从先前制备好的蔗糖梯度液顶部移除1毫升液体。

将细胞质裂解物的上清液逐滴覆盖在蔗糖溶液上。样品加在梯度液顶部后，小心地将离心管和配平管放入摆动桶转子的吊桶中。对梯度液进行100分钟的离心。

超速离心后，将离心管保留在离心桶中，在4摄氏度下静置20分钟，使梯度稳定。然后小心取出样品管，并将其安装到密度梯度分级系统的收集装置上。在使用紫外可见光检测器监测核酸在260纳米处吸光度的同时，收集每份1毫升的组分，并将其置于冰上。

接下来，准备30–40微升目标组分的分装样品，并置于冰上保存。若样品不能立即使用，请将其储存在–80摄氏度环境中，并尽量减少冻融循环次数。为进行原子力显微镜（AFM）成像，首先在经清洗的云母片表面加入200微升1毫摩尔的硫酸镍(ii)，室温孵育3分钟。

然后移除溶液，用压缩空气吹干表面，并将培养皿置于冰上。接着，将目标组分中的全部等分试样逐滴轻柔地加到云母表面。使用100或200微升枪头，将样品均匀铺展至云母的整个表面，并在冰上孵育3分钟。

然后，逐滴加入 200 微升预冷的 AFM 缓冲液覆盖云母片，并将样品置于冰上孵育 1 小时。保持样品温度为 40 摄氏度，并使用在无 RNase 水中配制的预冷缓冲液，这对于维持多核糖体的结构完整性至关重要。孵育结束后，小心移除缓冲液，并用 200 微升预冷的 AFM 缓冲液将云母片轻轻洗涤 3 至 4 次，以去除多余的蔗糖。

然后，用冷洗涤液将云母清洗三次，并用纸巾吸去云母表面多余的水分。由于此时多聚核糖体中的核糖体和游离RNA均已断裂，因此必须彻底去除吸附样品中的蔗糖。将培养皿盖部分打开，置于通风橱中让样品自然干燥。

两小时后，关闭培养皿。样品现可在室温下保存。使用双面胶带将制备好的样品固定在原子力显微镜（AFM）的样品台上。

然后，根据制造商的说明将样品台插入原子力显微镜（AFM）载物台。完成校准后，使样品接近探针悬臂，直至探针尖端与样品表面接触。选择扫描区域为 2 × 2 微米，分辨率至少为 512 × 512 像素，启用实时背景扣除模式，并选择 Z 轴范围为 20–25 纳米。

然后，开始图像采集。在空气中采集图像时，检查图像中是否存在高度在10至15纳米之间的圆形物体。接着，调整设定点和反馈参数，直至观察到清晰的物体。

在质量良好的样品中，背景应相对平坦，并分布有一些高度为两到四纳米的物体。当图像显示效果良好时，应在样品的不同区域采集多幅 2 × 2 微米的扫描图像。在蔗糖等分试样沉积于云母表面后，原子力显微镜（AFM）可提供单个多聚核糖体的精确尺寸描述，这些多聚核糖体表现为紧密排列的核糖体簇。

通过横截面分析仔细观察其中一个核糖体峰，可发现核糖体峰的高度约为14纳米。这与此前在空气干燥后观察到的人类核糖体和多聚核糖体的结果一致。在右侧图像中，使用了一个宏程序来识别核糖体的位置，并用红色圆圈标记每个核糖体。

利用这些信息，可以分析每个多聚核糖体上核糖体数量的频率分布。该实验分布通过高斯曲线进行拟合，中心值为每个多聚核糖体5.8个核糖体，标准差为1.3。一旦掌握，从脑组织粉碎到多聚核糖体图像采集的整个技术流程，若操作得当，可在八小时之内完成。

在进行该实验操作时，重要的是始终将样品置于冰上，并使用预冷的缓冲液将样品沉积到云母片上。按照此方法操作，并结合开发者提供的ImageJ插件以便在论文中使用，即可精确计数每个多聚核糖体中的核糖体数量。通过不断优化该技术，将有助于深入理解多聚核糖体形成的动力学过程，并揭示其在不同细胞或组织状态下多聚核糖体结构的变化。

观看本视频后，您应能充分了解如何获取数千张多聚核糖体图像，以系统性地分析和研究其结构组织。