应激条件下通过多聚核糖体分析检测翻译起始

本实验的总体目标是通过多聚核糖体分析，检测应激条件对哺乳动物细胞和组织翻译起始过程的影响。首先用抗癌药物处理哺乳动物癌细胞，然后制备细胞裂解物；第二步是制备蔗糖梯度。

接下来，将细胞提取物加样到蔗糖梯度中，通过超速离心分离核糖体组分。最终，利用特异性抗体进行蛋白质印迹分析，以评估待测蛋白质与多聚核糖体的结合情况。该技术相较于代谢标记等现有方法的主要优势在于，能够评估应激条件对翻译起始阶段的影响。

该方法有助于解答应激治疗领域的关键问题，例如抗癌药物是否以及如何影响翻译起始过程。该技术的应用意义延伸至癌症治疗领域，因为它有助于揭示翻译起始过程中的新调控通路。尽管该方法可为细胞培养中的翻译起始调控提供深入见解，但也可应用于其他系统，如分离的组织，包括脑组织和肿瘤组织。

首先，为准备自动密度梯度分馏系统，用0.1% SDS清洗装置的管路系统5分钟。然后用70%乙醇清洗管路系统5分钟，接着用RNA Zap溶液清洗5分钟。最后，用DEPC水冲洗后，通过向系统中泵入空气将管路系统干燥。

接下来，配制15%和55%的蔗糖溶液，使用ISCO Model One 60梯度形成仪生成15%至55%的线性蔗糖梯度。根据制造商的说明，在梯度形成程序运行期间，需仔细控制Tris蠕动泵的速度，以避免梯度中产生气泡或湍流。同时将超速离心机预冷至4°C。将蔗糖梯度置于4°C保存，直至使用。本实验采用低代次的Hela宫颈癌细胞，这些细胞此前已接种并培养至80%融合度。

实验当天，必须使用新鲜细胞进行提取，并在操作过程中避免RNA污染。在加入抗癌药物前90分钟，将细胞培养基更换为新鲜的完全培养基。为促进翻译反应，将细胞放回培养箱中继续孵育。

将抗癌药物直接加入细胞培养物中作为对照添加。加入DMSO，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育四小时。孵育结束后，将培养板置于冰上，用预冷的PBS洗涤细胞三次，然后在1毫升裂解缓冲液中收集细胞。为获得最佳结果，每种实验条件建议使用约1200万细胞。

将刮取的培养皿中的细胞转移至离心管中，用注射器反复吹打15次以充分混匀。将细胞裂解液置于冰上静置15分钟。随后，取少量细胞裂解液滴加到载玻片上，使用10倍物镜通过相差显微镜观察细胞裂解情况。

在确认细胞裂解后，于4摄氏度下以11,000 G离心20分钟，澄清细胞裂解液。将含有多聚核糖体的可溶性裂解液转移至新离心管中，并置于冰上保存，待用于后续将细胞质提取物加载至蔗糖梯度。使用分光光度计准确测定RNA浓度，并缓慢加载约20个OD260单位的提取物至15%–55%的蔗糖梯度中。

确保离心管管口留有2至3毫米的可用空间，以避免在离心过程中液体溢出。将离心管装入转子中。将转子放入超速离心机，于4°C条件下以230,000 ×g离心2小时30分钟。

离心完成后，取出离心管并小心地置于冰上，避免扰动密度梯度。为开始细胞质提取物的分级分离，将蔗糖梯度置于自动密度梯度分离系统上，并按照制造商说明进行自动分级分离及组分收集。在梯度分离操作的同时，持续监测250纳米处的吸光度，每管收集0.5毫升组分至单独的einor管中。每次运行结束时，多聚核糖体图谱将显示在记录纸上。

将收集到的组分转移至冰上的离心管中。开始此操作时，向每份收集的组分中加入两倍体积的100%冷乙醇，并在-20摄氏度下静置过夜，使RNA-蛋白质复合物沉淀。为提取蛋白质，先用70%乙醇洗涤各RNA-蛋白质沉淀，然后在4摄氏度下以11,000 ×g离心20分钟，空气干燥后重悬沉淀物。

在进行RNA提取的Western印迹分析之前，向每个RNA蛋白沉淀中加入含有0.1% SDS的裂解缓冲液重悬沉淀物，并加入终浓度为2毫克/毫升的蛋白酶K消化沉淀中的蛋白质组分，37°C水浴中孵育30分钟。随后加入等体积的苯酚-氯仿、两倍体积的氯仿以及0.1倍体积的2摩尔/升、pH为4的醋酸钠溶液，混匀后置于冰上静置15分钟。

在4°C条件下以10,000 × g离心20分钟。收集各样品的水相，通过加入等体积异丙醇和0.2微克/微升的糖原，在-20°C下过夜沉淀RNA。次日，在4°C条件下以10,000 × g离心1小时，收集沉淀。

去除上清液，用 70% 冷乙醇洗涤 RNA 沉淀，将 RNA 沉淀重悬于少量无 RNA 酶的水中。使用分光光度计评估 RNA 的浓度和质量。

图中显示的是从细胞质提取物中获得的典型多聚核糖体图谱。样品来自在正常条件下培养的Helo细胞，或经蛋白酶体抑制剂处理四小时后的Helo细胞，并在15%至55%（体积/重量）的线性蔗糖梯度中进行离心。每条图谱中标注了40S核糖体、60S核糖体、80S单体及多聚核糖体的位置。

从左到右依次显示密度梯度从顶部到底部的各组分；收集各组分后，使用针对大核糖体蛋白L28以及多聚核糖体相关蛋白FMRP的抗体进行Western印迹分析，二者在正常生长条件下可作为多聚核糖体完整性的对照。翻译起始复合物会转化为多聚核糖体，通过多聚核糖体分析对其进行检测，可反映活跃的翻译起始过程，如本实验中所观察到的结果。使用蛋白酶体抑制剂处理后，多聚核糖体峰减少，同时80S单核糖体峰相应增加，表明翻译起始受到抑制。在进行该实验操作时，需注意在RNase-free环境中操作，小心处理密度梯度，并严格控制细胞裂解情况。

为了回答其他问题，例如特定蛋白质或M MNA与多聚核糖体的关联如何受到抗癌治疗的影响，还可以进行诸如Western印迹和Northern印迹等其他方法。该技术的建立为从事真核翻译研究领域的研究人员铺平了道路，使其能够深入探索翻译起始因子调控在癌症和神经退行性疾病等人类疾病中的影响。