以最少样品和最大程度自动化模式进行基于核磁共振的片段筛选

我们开展核磁共振研究，这使我们能够确定蛋白质、RNA 和 DNA 在溶液中的结构。这些生物大分子是细胞的组成成分，而本文所介绍的实验方案涉及小分子的筛选及其与这些靶标分子的结合。

从这些分子出发，我们的药物化学与结构生物学研究能够开发出对抗疾病的新药。本技术的主要优势在于，我们能够完全控制分子靶标（如蛋白质）的质量，同时也能完全控制小分子片段及药物的质量，并且还可以对蛋白质进行广泛亲和力范围的结合筛选，这是相较于其他方法的优势所在。为准备用于核磁共振（NMR）检测的筛选样品，需使用样品制备机器人将768种化合物分配至八个96孔板中，从而获得64个混合物，每个混合物包含12个片段，最终浓度为每混合物4.2毫摩尔。

将目标生物大分子用适当的筛选缓冲液稀释后，转移至相应数量的带条形码的三毫米核磁共振高通量样品更换管中，并使用机器人将每种配体混合物各10微升加入每根含有目标生物大分子的样品管中。随后，由机器人充分混合各溶液。进行核磁共振检测时，将样品装入波谱仪中。

打开波谱仪软件，然后选择基于配体实验的参数集和脉冲序列。对于所列出的所有实验，选择激发塑形法作为水信号抑制方法。对于氟-19筛选，选择一维（1D）和T2实验。

将谱宽设置为220 ppm，激发频率设置为140 ppm，分析时间设置为1至5小时。对于T2，CPMG时间应在5至100毫秒之间交替变化。记录T1r和T2实验。

将饱和转移差值记录为伪二维谱。处理两个单维谱时，使用AU程序的ProcStd功能，可选择是否使用relax选项。WaterLOGSY为单维谱，其溶剂信号应以负相位进行相位校正。

为分析氢谱筛选数据，请按照片段筛选工具的说明，存储筛选实验中获得的生物分子磁共振核磁共振（NMR）数据，使每个筛选混合物都有其独立的目录，且该目录下包含一个子目录，用于存放针对该样品所测量的不同实验数据。将参考谱图数据存储在独立目录中，这些参考样品包含混合物和单个化合物，但不含生物分子靶标。创建一条指向包含所采集数据目录的直接路径，并选择NMR目录，其中所有混合物应各自拥有独立的子目录。

确保 CSV 文件、片段筛选文件、XML 文档和 BAC 文件也已复制到数据的 NMR 目录中。要对已筛选的样本使用基于片段的筛选工具，请将基于片段的筛选项目符号拖入分析窗口中央。如果之前保存的数据集已复制到该目录中，此符号应会显示。

基于片段的筛选选项窗口应自动打开。选择一个包含混合物名称、各个片段名称以及各片段在混合物中分配情况的 CSV 鸡尾酒文件。定义一个参考配体光谱文件夹，其中包含所有单个片段的实测光谱数据，并定义一个参考空白实验文件夹，该文件夹通常包含不含被研究靶标的混合物数据集。

为了定义待分析的光谱及光谱显示颜色，请打开“光谱类型”选项卡，并根据工艺数据设置光谱类型。在“显示布局”选项卡中，根据光谱类型定义将进行比较的光谱。然后，单击“确定”以启动项目。

在数据处理过程中，将打开一个独立窗口，显示汇总所有混合物组合及每种混合物中配体的表格。双击单元格可打开相应的数据集。在指定结合分子之前，需确保参考峰相互匹配且化学位移相同。

若观察到差异，请打开“处理”选项卡，使用串行处理选项进行校正。对于氟-19混合物的首次分析，请打开“分析”选项卡并选择积分功能。确保为混合物中每个组分的相应氟-19信号明确定义清晰的积分区域。

保存导出的积分区域，以便将来使用时导出积分文件，并将任何已使用的积分文件保存到相应的安装目录中。对于氟-19 数据，打开包含或不包含被测目标的 dataset，在“分析”选项卡下，单击“积分”并选择“读取导入积分区域”，以将相应的积分文件加载到当前谱图中。然后，单击“保存并返回”，在“积分”选项卡中定位积分区域列表，并将此信息复制到电子表格中以进行下游分析。

使用分子置信度软件分析片段库中配体的分子结构或组成，并以图形化形式展示结果。橙色表示该片段在结构或浓度上存在不一致，绿色表示该片段一致。

在此代表性分析中，从内部化合物库中选取了103个含有一个或多个氟基团的片段，将其分为五组混合物，每组包含20至21个片段。对每种混合物均进行了氟-19横向弛豫实验，并应用了CPMG脉冲序列。如在这些典型的硫胺素蛋白酪氨酸激酶A和RNA谱图中所观察到的，阈值可用于界定混合物中的结合物、弱结合物或非结合物。

在此代表性分析中，化合物“hit one”的T2弛豫时间减少了约50%，且化学位移大于或等于6赫兹。WaterLOGSY实验未显示显著的信号变化，因此不计为阳性。但由于三项实验中有两项结果为阳性，该片段仍被判定为有效命中。

对于第二个阳性结果，T2信号强度下降了约80%。WaterLOGSY实验也观察到明显的信号变化。该实验中的化学位移变化虽不显著，但由于前述两项标准均为阳性，仍将其判定为阳性结果。

这些方法的最终目标是开发出针对某些靶点（例如酶）的新药物或高亲和力抑制剂，在这一过程中，药物化学将接手并合成这些新分子；而结构生物学及其在此应用的技术能够指导药物化学研究，使该过程大大加快。