使用支撑漂浮块制备透射电子显微镜样品支撑膜

本文介绍了使用新型漂浮支架制备载有支持膜的冷冻电镜样品的改进方案，该支架有助于操作此类脆弱的支持膜。此方法的关键优势在于，可使样品免受气液界面的损害，避免发生变性等不良影响。本文所介绍的其中一种方案无需任何昂贵的处理步骤即可使石墨烯表面亲水化，从而提高了整个电镜领域研究人员对该方法的可及性。

目前，小型漂浮装置尚未在透射电子显微镜的良好制样中得到广泛应用。因此，这些可视化演示可为其使用提供一个基准。首先，用双蒸水和乙酸乙酯清洗透射电镜载网，随后进行等离子清洗。

然后将10至12微升样品加入缓冲液交换孔中，将浮力块以及10至12微升2%醋酸铀溶液加入相邻的非缓冲液交换孔中，用于负染色。操作染色剂时必须采取适当的安全防护措施。小心切割两小片表面已预先沉积碳膜的云母片。

确保云母碎片的宽度足以放入孔中，且长度超过孔的长度，使碎片能够搁置在孔上，同时碳膜漂浮在液面，并留有足够空间可用镊子操作碎片。将云母以约45度角浸入孔中，直至云母落在孔的斜坡上，并观察到碳层位于液体样品表面。将碳膜与样品孵育后，极缓慢地取出云母片，以回收碳膜并尽量减少黏性残留样品的附着。

用滤纸轻轻拍打云母的下侧非碳表面，以吸去多余液体，然后将云母碎片浸入另一个含有2%醋酸铀溶液的孔中，用负染液置换碳层。用经洗涤和等离子清洗后的电镜载网的有孔碳支持膜一侧，捞取漂浮的碳膜。随后将载网置于空气中干燥，最好覆盖起来以避免空气中的污染，待透射电镜成像时使用。

按照之前演示的方法清洗透射电镜载网后，于使用前新鲜制备氧化石墨烯悬浮液，并充分涡旋振荡。然后沿漂浮块的四个非缓冲液置换孔中各加入 10 至 12 微升氧化石墨烯悬浮液。

向模块中剩余的四个换液孔内各加入 10 至 12 微升双蒸水或超纯水。将四片载网轻轻放入各孔的氧化石墨烯悬浮液中，确保有孔碳覆盖的一侧与溶液接触，孵育一分钟。一分钟后，将镊子插入每个非换液孔的镊子槽中，小心地逐一取出每片载网。

轻轻且短暂地用相邻孔中的双蒸水触碰每个载网的铜质非碳膜面，直至在载网上可见水滴。然后小心地将带有水滴的载网倒扣在一张滤纸上。盖上盖子，将载网留在镊子中自然晾干。

将四个载网放置在置于载玻片上的铜支撑石墨烯薄膜上，并在每个载网上滴加一滴异丙醇，以确保单层石墨烯与载网之间充分接触。待异丙醇完全蒸发后，将带有载网的铜支撑石墨烯薄膜漂浮于玻璃培养皿中的氯化铁溶液中。然后盖上培养皿盖以防止空气污染，并在室温下静置过夜进行刻蚀。

使用直径大于透射电镜（TEM）载网尺寸的环圈，将漂浮在单层石墨烯上的载网捞出，并小心转移至含有双蒸水的玻璃培养皿中进行洗涤。将载网在水中洗涤两次，然后转移至含有样品缓冲液的培养皿中，直至进行样品制备和冷冻处理。向浮力块的孔中加入 10 至 12 微升样品。

当样品在载样块中准备就绪后，用一对洁净的镊子从缓冲液中取出镀有石墨烯的载网，将其放置于含有样品的孔表面。经过适当的孵育后，用一对洁净的冷冻镊子夹起载网，进行滤纸吸干和玻璃化冷冻。使用支持漂浮载样块制备的负染载网通常在整个载网表面覆盖有无定形碳。

尽管在某些情况下碳膜会发生破裂，但大量网格区域保持完好，因此适用于负染色。同样，采用氧化石墨烯方法可实现在整个载网上的良好成膜覆盖。氧化石墨烯载网可由原始材料快速制备，并能对样品提供高度保护。

在冷冻前保持石墨烯湿润并原位施加样品，足以生成适合冷冻电镜观察的冰层。该方案无需使用设备使石墨烯亲水化，且有利于样品回收。支撑漂浮块在每个孔位处设有两个针孔，可使缓冲液在C2中延伸，这对于来自甘油梯度的样品尤为有用。

通过利用可控的小体积缓冲液流动以及功能化支撑膜，浮力块已实现了对网格上亲和纯化方法的探索。