神经节苷脂的提取、纯化与分析

神经节苷脂表达于所有脊椎动物细胞表面，在神经细胞中尤为丰富。它们调控细胞信号传导和细胞间识别。本方案介绍了神经节苷脂的分离与分析方法。

所选技术旨在大规模和小规模操作中最大化神经节苷脂的得率，同时简化纯化流程。我们还介绍了相对快速进行神经节苷脂定性和半定量分析的方法。脂质研究，尤其是神经节苷脂等极性脂质的研究，需要采用不同于蛋白质或核酸研究的工具和技术。

本视频将帮助您熟悉如何操作这些分子。由于氯仿和四氢呋喃等溶剂可溶解普通塑料，因此在整个实验过程中，我们均使用带聚四氟乙烯（Teflon）衬里瓶盖的玻璃瓶和玻璃小瓶、玻璃移液管、玻璃或不锈钢微量注射器以及聚四氟乙烯玻璃匀浆器。若不采取此措施，产物中可能混入塑料聚合物，从而干扰后续分析。

首先，按每克组织湿重加入 4.1 毫升水，匀浆 10 次。然后按每克组织加入 13 毫升甲醇。将样品转移至 22 摄氏度的环境温度下，混匀。

将组织转移至带有聚四氟乙烯（PTFE）衬垫螺旋盖的厚壁玻璃螺口管中，并充分混匀。每克组织加入6.5毫升氯仿，盖紧盖子后充分混匀。在450 × g 条件下离心15分钟。

然后将澄清的上清液转移至一个新的带螺口盖的离心管中，并测量其体积，记为回收提取液体积。进行分配时，向澄清的上清液中加入相当于回收提取液体积0.173倍的水，然后盖紧管盖。

剧烈涡旋。在450 × g下离心15分钟。将含有神经节苷脂的上层相转移至带有聚四氟乙烯衬里螺旋盖的新玻璃管中。

进行反相柱色谱时，使用一个5毫升的玻璃注射器，用3毫升甲醇洗涤tC18固相萃取柱。然后加入3毫升氯仿-甲醇-水溶液，其比例为2:43:55。通过同一玻璃注射器，将上一步骤中的上层相加载至tC18柱上。

收集流出液，并重新加载到柱子上以优化吸附。用 3 毫升氯仿-甲醇-水洗涤柱子，随后用 3 毫升甲醇-水洗涤。用 3 毫升甲醇洗脱神经节苷脂至一个新的带螺口盖的试管中。

在不超过45摄氏度的温度下，用温和的氮气流吹干至完全干燥。按每克原始组织湿重加入1毫升甲醇的比例溶解。取100克脑灰质放入匀浆器中，按每克脑组织湿重加入1毫升的比例加入预冷的、pH为6.8的10毫摩尔磷酸钾缓冲液。

然后以低速匀浆20秒。每克脑组织湿重加入8毫升四氢呋喃，再以低速匀浆10秒。将混合液倒入玻璃离心管中，在5,000 × g离心15分钟。

收集上清液，测量其体积，然后转移至玻璃分液漏斗中。每毫升上清液加入0.3毫升乙醚，剧烈振荡。

然后静置30分钟，期间会分离出两相：上层为乙醚相，下层为水相。将含有神经节苷脂的下层相收集至带有聚四氟乙烯衬里瓶盖的玻璃瓶中。向分液漏斗中残留的上层乙醚相中，每毫升前一步骤的原始上清液加入0.1毫升水。

剧烈振荡。静置分层后，收集下层水相，并与先前收集的下层相合并。

将合并的下层相蒸发至干燥粉末，并称重。进行反相色谱时，使用真空或加压方式，每次冲洗用时少于1分钟，通过柱子依次加入50毫升溶剂，对大规模tC18固相萃取柱进行预洗涤。通过真空或加压，将皂化后相分离所得的上层相加载到柱子上。

然后收集流穿液，重新上样，再次收集流穿液用于后续分析。用氯仿-甲醇-水和甲醇-水各30毫升依次洗涤层析柱。随后用50毫升甲醇洗脱神经节苷脂，再用10毫升甲醇再次洗脱。

分别收集每次洗涤液和洗脱液。采用薄层色谱法（TLC）确认神经节苷脂未出现在流穿液和洗涤液中，而是在甲醇的第一次洗脱液中被洗脱出来。将洗脱得到的神经节苷脂蒸发至干燥粉末状，并称重。

进行薄层色谱（TLC）时，将展开溶剂倒入一个10厘米×10厘米、带不锈钢盖的玻璃TLC展开槽中，使溶剂深度为0.5厘米。盖上盖子，让展开槽平衡约10分钟。用甲醇清洗一支10微升的Hamilton微量注射器及其斜面针头。

用玻璃注射器吸取1 µL甲醇，以填充针头的死体积，然后再吸取1 µL样品或标准品。将样品均匀点样至5 mm的预标记线上，直至注射器中剩余的甲醇溶剂少于1 µL。所有样品点样完成后，让薄层板在22 °C下自然干燥。

将点样并干燥后的薄层板放入预先平衡好的薄层色谱展开槽中，使板的底边浸入展开剂中。让展开剂通过毛细作用沿薄层板上升，直至溶剂前沿距板顶端约1厘米处。取出薄层板，用铅笔在板边缘标记溶剂前沿位置。

让溶剂在静置或轻微气流条件下完全蒸发。在化学通风橱内，将薄层色谱板上已分离的神经节苷脂原点端朝下放置于一个切去部分的纸板箱中，以保护通风橱内壁免受酸雾喷溅。将间苯二酚喷雾试剂装入玻璃薄层喷雾器中。

将其连接至加压氮气源，然后沿垂直和水平方向轻轻斜向喷吹载样板。立即用一块洁净、干燥、尺寸相同的玻璃盖板覆盖载样板，并用长尾夹固定盖板。将加盖的载样板在125摄氏度下加热20分钟。

神经节苷脂将在白色背景上呈现深紫色。进行脂质染色时，将薄层色谱板已分离的神经节苷脂一端朝下浸入盛有茴香醛染色剂的烧杯中，浸没至展开前沿，持续略超过两秒钟。

然后让其自然沥干。将薄层色谱板置于低温加热板上加热以展开。该方案可提供足量且纯度足够的神经节苷脂，用于定性和定量分析。

一微升样品在薄层色谱（TLC）上的分离足以提供充足的材料用于间苯二酚显色检测，并可分辨野生型及基因修饰小鼠脑组织中的所有主要神经节苷脂。尽管制备的神经节苷脂混合物仍含有其他主要脂类成分，但其纯度已足够用于质谱分析，既可在负离子模式下直接分析天然纯化的神经节苷脂，也可在甲基化预处理后采用正离子模式分析。大规模纯化流程包括提取、皂化及高效液相色谱（HPLC）分离，最终获得适用于生物学实验以及进一步化学和酶法修饰的高纯度主要脑源性神经节苷脂。

展示了典型的高效液相色谱（HPLC）图谱及随后的薄层色谱（TLC）分析结果。碱处理（即皂化）对于水解并去除污染性磷脂是必要的，但同时也会水解神经节苷脂的天然修饰基团，例如O-乙酰化唾液酸，而这些修饰在某些情况下可能具有重要意义。准确的溶剂比例对于提取、溶剂分配以及薄层色谱分离至关重要，有助于提高回收率、纯度及分析效果。

从癌症到代谢再到脑功能，神经节苷脂都是重要的生理调节因子和治疗靶点。神经节苷脂的分离、纯化与分析是生物医学发现和治疗开发的基石。