利用DiCoExpress分析多因素RNA-Seq实验

DiCoExpress 提供了从质量控制到共表达分析的完整启始分析流程。它基于广义线性模型内的对比进行差异分析。此外，它还可以对差异表达基因列表及共表达基因簇进行富集分析。

DiCoExpress 的主要优势在于，像我这样的普通用户无需具备统计学或编程方面的专业知识即可使用。它能够切实帮助非专业用户编写基因差异表达分析所必需的对比参数，同时还提供可用于发表的图形化结果输出。

DiCoExpress 并非专用于特定方案的工具。只要实验设计完整且最多包含两个生物学因素，该工具即可用于任何生物体。此外，即使不同条件下重复数量不等，也可进行膜的设计。

初学者应具备 R 语言的初步知识，应了解如何使用函数并识别必需和可选参数。关键步骤是正确提供包含数据和实验设计的文件。首先，打开 R Studio 会话。

将目录设置为模板脚本，然后打开 DiCoExpress 教程的 dot R 脚本。在 R 会话中加载 DiCoExpress 函数。接着在 R 会话中加载数据文件，并将对象数据文件拆分为多个对象，以便更方便地操作这些文件。

接下来，在 NB 条件或 NB 重复之间选择一种策略，并设定阈值以过滤低表达基因。指定分组颜色并选择一种标准化方法，然后进行质量控制。

如果数据根据重复因子成对，则将重复设为“true”，否则设为“false”。将交互作用设为“true”以考虑两个生物学因素之间的交互作用；否则设为“false”，然后指定统计模型并定义错误发现率的阈值。

进行差异分析，随后设定富集分析的阈值，并对差异表达基因列表进行富集分析。选择要比较的差异表达基因（DEG）列表，为列表比较提供一个名称，并使用相同的名称作为保存输出文件的目录名称。

将参数操作设置为并集或交集，以指定对差异表达基因列表执行的操作，并对列表进行比较。随后进行共表达分析，接着对共表达簇进行富集分析。最后，生成两个日志文件，其中包含重现该分析所需的所有必要信息。

在比较组内和组间条件时，每个样本的总标准化计数应相近。标准化基因表达计数在组内和组间条件下均表现出相似的中位数和方差。为了识别潜在的数据结构，生成了主成分分析（PCA）图。

在不同处理组之间观察到明显的区分，且无聚类现象，表明数据集质量良好。绘制了原始 p 值的直方图以评估建模质量。原始 p 值的分布呈均匀分布，且在分布的左侧末端出现峰值，符合预期。

右侧末端无峰表明统计建模似乎是正确的。绘制了基因 CIG62301.1 在每种基因型和条件下的表达谱。同时，针对每次测试对比，也绘制了上调和下调差异表达基因的数量。

对五个差异表达基因（DEG）列表的并集进行了共表达分析。通过对比，寻找基因型一或基因型二与其他基因型之间在处理响应上的差异。每个已鉴定簇的共表达基因均被输出至单独的文本文件中，并绘制了基因的表达谱。

通过使用DiCoExpress，生物学家将获得统计学上严谨的基因表达分析结果。下一步则是从这些结果中解读出生物学意义。