通过RNA-Seq分析表征人原代角质形成细胞的体外分化

本方案包含两个部分。首先，通过接触抑制在体外建立角质形成细胞单层二维分化的方法；其次，利用RNA测序对其进行分子表征。

二维体外分化方法简单且易于操作，可用于研究表皮分化，尤其适用于需要大量细胞的情况，例如表观基因组学分析。

对于具备基本生物信息学技能的研究人员而言，详细的RNA-seq分析流程清晰且透明，可适用于任何批量RNA-seq分析。首次执行分化方案时，请注意接种密度可能较难掌握。建议尝试多种接种密度，以确定最适合您细胞系的接种条件。

首先，根据文稿说明配制角质形成细胞生长培养基（KGM），以及各500毫升的增殖培养基和分化培养基。以每平方厘米5,000至20,000个细胞的密度接种原代角质形成细胞，并加入足量增殖培养基以覆盖细胞。接种后两天，用增殖培养基更换培养液。

定期在显微镜下观察细胞，并每隔一天更换一次培养基。当细胞融合度达到90%时，更换为成肌分化培养基以诱导分化。如需收集细胞进行后续RNA分析，先用DPBS洗涤细胞两次，然后加入裂解缓冲液。

在分化第0天、第2天、第4天和第7天收集细胞。RNA提取后，将合成双链cDNA，并构建RNA-seq文库用于下一代测序。测序完成后，下载测序读长并将其比对至人类基因组。

下载并安装 R 软件包后，从 readspergene.out.tab 文件生成计数表，并编写一个样本数据文件，包含所有文件名、分化天数及其他相关样本信息。示例请参见补充代码文件。

然后使用计数表和样本数据生成一个包含计数数据和样本数据的 DESeq2 对象。对于基因表达标准化，可使用 DESeq2RLD 或 VST 标准化方法对 DESeq2 对象中的计数表进行标准化。其中 RLD 标准化更推荐使用，但 VST 标准化速度更快。

使用 R 中的 dist 函数，根据标准化的读段计数强度绘制样本距离图，然后基于样本距离进行 hclust 聚类分析。接着，利用 pheatmap 函数绘制热图。最后，使用 deseq2 的 plotPCA 函数对标准化的读段计数强度进行主成分分析（PCA），并生成 PCA 图。

主成分分析（PCA）是探索性数据分析中的一种工具，可用于可视化不同样本之间的距离和关联关系。使用 rowVars 函数进行高变异性基因表达分析，该函数通过按不同时间点样本间的方差排序，提取前 500 个高变异性基因。这些基因在分化各天的标准化表达强度中具有最高的标准差。

对高变基因进行k均值聚类，以根据不同的表达模式对其进行分组。使用pheatmap包将基因在热图中可视化。热图中绘制的强度值为DESeq2标准化后的强度值减去中位数后的结果。

生成一个表达的背景基因列表，包含在单个样本中计数超过10的所有基因，并列出每个簇中的基因。最后，使用GOrilla进行基因本体（Gene Ontology）分析。将背景基因列表作为背景基因集，将各簇中高变基因列表作为目标基因集，然后点击搜索富集的GO术语。

此外，更高级的 R 用户可以使用 clusterProfiler 软件包来自动化进行基因本体（GO）富集分析。RNA-seq 分析采用了来自五名个体的角质形成细胞系进行分化研究。主成分分析显示，处于分化过程中的角质形成细胞具有相互关联但又明显不同的整体基因表达谱型。

通过聚类高度可变基因以可视化分化过程中的基因表达动态和模式。每个基因簇均以角质形成细胞分化标志基因为代表，基因本体注释显示各簇基因功能存在明显差异。在第二项实验中，比较了来自健康对照者的角质形成细胞与携带P63突变患者的细胞系之间的细胞形态及基因表达差异。

主成分分析显示，对照细胞系明显遵循分化模式，而突变细胞在分化过程中的基因表达模式则与增殖或未分化细胞的基因表达模式大体相似。在聚类分析中，1号聚类中的基因在对照细胞中呈下调，在携带R204W和R279H突变的患者细胞中部分下调，但在携带R304W突变的细胞中仍保持高表达。基因本体分析表明，这些基因可能在细胞增殖中发挥作用。

第二组基因在对照细胞中首先被引入，随后表达下调。这些基因可能参与角质形成细胞的分化过程，因为该组基因在表皮分化和角化功能方面显著富集。第三组基因仅在对照细胞分化的末期被诱导表达，表明它们可能在表皮最外层中发挥作用。

在分析RNA-seq数据时，预先了解预期结果非常重要。这将有助于您解读质量控制结果和PCA图，并评估您的研究结果是否合理。我们的方法可用于研究表皮生物学以及其他生物系统中的基因转录。