使用荧光相关光谱法检测蛋白质聚集

荧光相关光谱（FCS）的基本原理最初于20世纪70年代被提出。在20世纪90年代，通过与共聚焦显微镜装置相结合，FCS实现了多项重要且关键的改进。自那时起，FCS已被广泛应用于多种化学及病毒治疗领域，例如分子相互作用和蛋白质聚集分析。

蛋白质聚集是神经退行性疾病的特征之一。荧光亮度反映了分子尺度下通过扩散特性所描述的单个粒子行为。在测量蛋白质聚集时，荧光亮度极为重要，因为它不仅可以确定分子的预期生命周期，还能区分同源或异源聚合。

在此，我们介绍一种利用荧光相关光谱法（FCS）在细胞裂解液和活细胞中检测与肌萎缩侧索硬化相关的聚集态蛋白扩散的实验步骤。准备一个100毫米的塑料培养皿，其中培养有处于正常生长培养基中的Neuro2a细胞。确认细胞汇合度。

移除培养基。向第三个 cartridge 培养皿中加入 3.5 毫升胰蛋白酶-EDTA 溶液，在 37 摄氏度下孵育 1 分钟。向培养皿中加入 9.5 毫升正常生长培养基并混悬细胞。

将细胞悬液与台盼蓝混合，以染色死细胞。将悬液加入细胞计数板。使用细胞计数器或手动计数细胞数量。

检测活细胞数量及其活力。用计数后的培养基将细胞稀释至每毫升1.0 × 10⁵个细胞。取2毫升细胞悬液加入35毫米塑料培养皿中，用于细胞裂解；或加入活细胞检测用的生长培养皿中。

将培养皿在37摄氏度下孵育一天。第二天，制备质粒DNA与转染试剂的混合物。将转染混合物加入已计数细胞的培养基中，并将细胞孵育24小时。

一天后，使用常规显微镜检测GFP表达。可以在细胞中观察到非常明亮的TDP25包涵体。

细胞裂解应在生化实验台进行。移除培养皿中的培养基，加入2 mL 25 °C的PBS作为洗涤液。

移除 PBS。将培养皿置于覆盖在碎冰上的铝板上。立即向培养皿中加入 200 微升裂解缓冲液。

使用细胞刮刀刮取培养皿。将含有未溶解细胞碎片的裂解液收集到新的1.5毫米离心管中。在4°C下离心裂解液。

进行活细胞测量时，测量前需更换为新鲜培养基。使用相差显微镜检查细胞贴壁情况，同时使用荧光显微镜检测GFP表达情况。

使用共聚焦显微镜结合的FCS系统。打开488纳米激光器。使系统稳定至少30分钟。

搭建光路。使用488纳米激光作为激发光源。使用合适的分束器和二向色镜。

此外，还有荧光融合器。通常，我们会使用盖玻片腔室进行校准和溶液测量。小心地取用盖玻片腔室。

将玻璃表面放置在镜头筛选纸上。倒入FCS校准液，同时加入罗丹明6G溶液。

将超纯水加在物镜上。请勿使用油。将样本室置于显微镜载物台上。

将载物台移动至适当位置。创建针孔调节并打开针孔调节向导。在对 x 方向的针孔进行粗调移动时，监测光子计数率。

已正确确定最亮位置。接下来，通过微调移动监测光子计数率。最亮位置已成功确定，此即为 x 方向的针孔位置。

同样地，搜索针孔在 y 方向上的最亮位置。y 方向的最亮位置也已成功确定。将针孔的 x 和 y 位置进行合并。

最好在每天测量前调整针孔位置。当活体路径改变时，必须再次调整针孔位置。创建计数率并监测光子计数率。

切换至 CPM 监测模式。调节所检测物体的校正环，使 CPM 值达到最高。关闭计数率窗口。

首先测量罗丹明6G溶液。测量完成后，单击拟合以执行曲线拟合分析。为旧的关联函数选择一个拟合模型。

对于罗丹明6G，选择包含三重态的单组分三维扩散模型。通过移动红线来设定拟合起始时间。点击“拟合全部”以开始拟合计算。

检查拟合偏差。确保两侧分布对称且为负值，接近零。检查拟合值。

确保扩散时间大致在20-30微秒范围内。此外，结构参数应在4到8之间。打开拟合面板，为测量选择一个模型。

在拟合面板中，为样品模型输入相同的结构参数值，并确保类型设置为固定。检测细胞裂解液中的GFP-TDP25。

将裂解液置于盖玻片腔室中。盖上盖子以防止裂解液干燥。放置载物台盖板以遮挡光线。

在采集面板中，设置激光功率、测量时间及其重复次数。开始采集。观察到一个尖峰信号。

再次观察到一个峰。该峰表明有明亮的分子通过了检测区域。峰的存在提示可溶性寡聚体或聚集体的存在。

创建拟合以执行曲线拟合分析。选择包含三重态的双组分三维扩散模型。设置拟合起始时间。

单击“全部拟合”。检查拟合值。在活细胞中对GFP标记的SOD1-G85R进行检测。

与溶液测量不同，我建议使用加热台孵育器。将细胞培养皿放置在显微镜载物台上，使用目镜确认焦距和位置。

选择一个测量细胞。使用快速扫描模式放大并调整细胞位置。使用慢速扫描模式获取细胞的图像快照。

使用位置工具选择一个FCS测量位置。十字准线指示测量位置。开始测量。

光子计数率记录的轻微下降表明GFP发生了光漂白。进行曲线拟合。图中显示了细胞裂解液中GFP-TDP25的代表性结果。

上方的图表记录了光子计数率。有箭头的位置出现尖峰，表明存在可溶性寡聚体和聚集体。中间的图表表示传统的相关函数。

灰色线条表示低且陈旧的相关函数。品红色线条表示拟合函数。虚线表示拟合的起始和结束时间。

下方的表格显示了拟合值。接下来，展示了活细胞中 SOD1-G85R-GFP 的代表性结果。上方的图表表示我们的光子计数率记录。

观察到记录的光子计数率逐渐下降，表明在不同测量中GFP存在光漂白现象。这是由于在活细胞中扩散速度较慢所致。中间的图表表示SOD1的旧相关函数。

灰色线条显示较低的旧相关函数。品红色线条显示拟合函数。虚线表示拟合的起始和结束时间。

下方的表格显示了拟合值。本文向您展示如何利用荧光相关光谱法（FCS）检测细胞裂解液中与每个细胞相关的TDP-25的扩散情况，以及活细胞中SOD1突变体的扩散情况。细胞裂解液中的可溶性寡聚体和聚集现象通常可观察为尖峰或爆发信号。

另一方面，在活细胞中，除了一些明显的活体结构外，这类尖峰信号很少被观察到。突变型 SOD1 的缓慢扩散物种会增加单个颗粒的平均亮度，例如 SOD1 在细胞内的同源多聚化。此处展示的实验步骤简单且具有重要价值。

FCS 不含辐射；处于直接的休眠状态。它只是你和我们共同的想象与共情。