利用红外纳米光谱与原子力显微镜表征单个蛋白质聚集体

基于原子力显微镜的方法使得在纳米尺度上以形态学、化学或结构分辨率表征生物分子过程成为可能，最终为生物学研究开辟了全新的观察窗口。单分子方法能够探测高度异质的系统，这一特性对于理解蛋白质聚集现象尤为重要。通过将单分子技术与回溯性方法相结合，我们可以获得关于蛋白质行为、其与人类疾病关联性的基本认识，并据此设计可能取得成效的药理学干预策略。

此外，该方法可成功应用于研究用于药物递送、相关应用及其他生物技术目的的生物材料的化学和结构特性。最初设置高分辨率原子力显微镜（AFM）的正确参数可能具有挑战性，但在测量纤维状聚集体时，很容易完成AFM的设置。在进行AFM成像前30分钟，打开AFM系统，点击“set up and probe”。

在探针更换窗口中，单击“下一步”以准备Z轴聚焦平台。如果原子力显微镜（AFM）光束开关处于开启状态，则将其关闭，并解锁燕尾锁。将探针头从系统上断开，然后在探针更换窗口中单击“下一步”。

将原子力显微镜（AFM）悬臂安装在探针支架上。将探头连接至系统并锁紧燕尾槽锁扣。打开AFM激光开关，在探针更换窗口中点击下一步。

在弹出窗口中，如果悬臂类型未改变，请点击“否”，并调节光学校准旋钮以找到悬臂。将焦距调整到悬臂上，然后点击“下一步”。在弹出窗口中，如果焦距已对准悬臂，请点击“是”。

使用检测激光束旋钮将激光束定位在悬臂末端。使用偏转激光束旋钮，使四象限光电二极管测得的总信号最大化，至少大于一伏特。在探头更换窗口中，单击下一步并关闭。

等待15分钟，使悬臂梁达到热稳定后，如有必要，重新调整偏转激光束在位置敏感光电二极管上的位置。点击NCM扫描，选择所需的振幅，点击使用相位并点击自动。将悬臂梁调节至其第一自由共振频率的最大值附近，对于弹簧常数为40牛顿/米的悬臂梁，共振频率约为300千赫兹。

将样品放置在样品台上。点击扫描区域，将分辨率设置为256×256至1024×1024像素，然后设定扫描尺寸和像素数。对于1×1至5×5平方微米的扫描区域，将扫描速率设置为0.3至1赫兹。

将光学视图聚焦于样品，点击“接近”以使探针接近样品表面。随后，点击“抬升100微米”将原子力显微镜（AFM）探针抬升至样品表面上方100微米处，并点击展开样品的光学图像。点击聚焦载物台栏，使视野聚焦于样品表面，并使用方向箭头移动至样品中感兴趣的区域。

点击“接触”以使探针接近表面，然后点击“线扫描”以检查探针是否良好跟踪表面。根据需要调整设定点。随后点击“扫描”以开始对样品表面成像，成像过程中保持恒定的相位变化范围，不超过Δ20，以避免过大的成像作用力，并确保不同独立样品之间的成像一致性。

进行红外纳米光谱成像前 30 至 60 分钟，打开原子力显微镜红外系统（AFM IR）和红外激光器。启动内置的仪器控制软件，点击“文件”和“新建”，以打开一个新的纳米红外文件。点击“初始化”以启动原子力显微镜红外系统，并打开仪器盖板。

将一个标称半径为30纳米、弹簧常数为0.2牛顿每米的硅金镀层探针安装到AFM IR系统上，以在接触模式下测量样品。在AFM探针部分点击“加载”（load），然后点击“下一步”（next）。使用“探针聚焦”（focus on probe）箭头将摄像头对焦到悬臂上，并使用“探针尖端对准十字线”（tip to crosshairs）功能将十字线置于悬臂末端。

旋转调节检测激光位置的旋钮，使激光对准悬臂梁末端。调节激光旋钮，以检测并最大化四象限光电二极管测得的信号总和，使其大于三伏特。旋转偏转调节旋钮，将悬臂梁的偏转调整至负一伏特，然后点击下一步。

然后关闭仪器盖子。使用聚焦探针箭头将摄像头对准样品和针尖，使用十字准线箭头移动至样品的兴趣区域。单击“下一步”并启动。

在显微镜窗口中，选择高度模式以观察形貌，选择振幅二以检测红外吸收，并选择PLL频率以映射探针与样品的接触共振。在原子力显微镜扫描区域，按照演示设置参数进行原子力显微镜成像，并点击扫描以获取形貌图。当形貌映射完成后，在显微镜窗口中点击高度图，将探针定位在一个聚集体的顶部。

在纳米红外部分，单击“开始红外”以用红外激光照射样品。为将红外激光聚焦到悬臂上，请单击“优化”并在波数处输入 1655 厘米⁻¹。单击“添加并扫描”以确定红外激光的位置，然后单击“更新并确定”以将其位置与悬臂对齐。

在常规设置部分，输入一个预计在相对场中具有高吸光度的波数，并关闭带通滤波器选项。单击“开始红外”后，检查仪表读数及悬臂梁响应的快速傅里叶变换（FFT）。在FFT窗口中，移动绿色光标以读取悬臂梁的共振频率。

悬臂梁共振的FFT典型值约为200千赫。在“通用”部分的“中心频率”字段中输入测得的共振频率值，并使用50千赫的频率窗口。单击“激光脉冲调谐窗口”以选择共振增强模式，并设置脉冲频率为222千赫，调谐范围为50千赫，激光占空比为5%。单击“采集”以扫描激光的脉冲频率。

使用光标调节激光脉冲，使其频率与样品吸收红外光后热膨胀的机械响应频率相匹配。然后选择锁相环以监测样品与探针之间的接触共振，并点击归零。对于纳米尺度的其他化学性质，在光谱采集过程中持续跟踪接触共振，以确保样品光谱不受过热和软化的影响。

选择启用以跟踪样品与探针接触共振，并设置积分增益为0.5，比例增益为10，然后点击确定。在优化窗口中，点击波长并扫描以定位红外激光，至少选择对应样品主要吸收峰的三个波数，以及每块激光芯片至少一个波数。点击工具、红外背景校准和新建，将波数范围设置在1200至1800厘米⁻¹之间。将背景平均次数设为1，占空比设为5%，扫描速度设为100厘米²。

单击“采集”以测量红外激光背景，用于对测得的纳米级局域光谱进行归一化处理，保存文件并关闭窗口。在红外光谱设置中，选择1至4 cm⁻¹之间的红外光谱分辨率，并设置至少64次的累加平均次数。然后单击“采集”以在蛋白质谱段范围内测量纳米级局域红外光谱。

为了获得纳米级分辨率的化学图谱，选择1655厘米和红外成像，并在AFM扫描窗口中点击扫描。当图谱采集完成后，保存测量数据。然后使用内置的AFM图像处理软件分析获取的形貌、接触共振、化学图谱以及纳米级局域光谱。

获得高纯度的单体溶液是一个关键步骤，因为聚集物的存在可能导致动力学实验的重复性差，并在测量中引入人为假象。对于具有高度异质性的生物样品，成功研究的一个基本因素是正确放置固体基底。为了保持样品的结构和异质性，可采用微流控喷雾沉积技术替代手动操作。

这些方法为揭示单个生物分子在生理和天然液体环境中的化学结构、性质及其相互作用奠定了基础。