基于固相支撑膜（SSM）电生理学的转运体靶向抑制性纳米抗体筛选

本方案用于高通量筛选和鉴定靶向蛋白脂质体中重建的或膜囊泡中天然存在的生电型转运蛋白的抑制性与非抑制性纳米抗体。在多种情况下，设计转运实验可能较为困难，尤其是当缺乏标记底物时。而固持膜斑块（SSM）电生理技术无需标记底物，因此原则上可应用于研究纳米抗体对任何生电型转运蛋白转运功能的影响。

纳米抗体已被研究用于医学应用。该技术可帮助筛选靶向人类或人类病原体特定生电转运蛋白的潜在抑制剂。首先，取10个洁净的试管，向每支试管中加入10毫升非激活型固相支撑膜（SSM）缓冲液。

为配制激活型SSM缓冲液，请使用一系列接近预期半最大浓度的浓度，将底物加入试管中。启动SSM软件并让仪器自动初始化。设置数据保存路径。

通过点击“确定”按钮进行确认。在工作流程选项中选择标准的初始清洁程序，然后点击运行。接下来，将涂有蛋白脂质体的芯片安装到插座上。

移动机械臂以锁定芯片。用盖帽将安装好的芯片封闭。在工作流程中选择程序 CapCom，并运行以测定电导率和电容。

使用前请确认电导率低于5纳西门子，电容在15至35纳法之间。将激活溶液转移至样品瓶中，并将缓冲液置于探针取样器的相应位置。将非激活缓冲液转移至储液池中，并将其放置在芯片 holder 右侧的储液池位置。

使用非激活溶液、激活溶液、非激活溶液的序列，即 BAB 序列，创建一个循环的实验流程，对全部 10 种激活缓冲液依次进行三次测量。采用默认流速 200 µL/s，BAB 序列中各步骤流速时间均为 1 秒，点击播放按钮以开始测量。保存该实验方案，然后点击播放按钮以运行整个流程。

然后使用无蛋白脂质体进行相同的实验。采用任意偏好的数据分析软件，绘制测得的电流随时间变化的曲线，并在加入激活缓冲液的时间范围内，使用峰高估测函数进行分析。绘制峰值电流随底物浓度变化的曲线，通过非线性回归分析确定底物的半最大效应浓度（EC50）。

将50毫升非激活型SSM缓冲液转移至洁净离心管中。加入底物胆碱，使其终浓度为5毫摩尔，并用此溶液进行阳性对照测定。将10毫升非激活型SSM缓冲液转移至另一洁净离心管中。

将底物胆碱加入至终浓度为5毫摩尔，纳米抗体加入至终浓度为500纳摩尔。按照上述方法，对每种纳米抗体重复该步骤，以制备激活溶液。启动SSM仪器，并测量包被有蛋白脂质体的芯片的电容和电导率，操作方法如前所述。

将不含纳米抗体的激活溶液转移至样品瓶中，并将缓冲液放入探针取样器内。将不含纳米抗体的非激活缓冲液转移至储液槽中，并将其置于探针取样器内。随后，对所有含有纳米抗体的激活溶液和非激活溶液重复此操作。

创建使用 BAB 序列的工作流程方案。建立一个循环，首先使用不含纳米抗体的缓冲液进行三次 BAB 序列测量，接着使用含纳米抗体的缓冲液进行两次 BAB 序列测量，随后加入纳米抗体并孵育 120 秒，最后再使用含纳米抗体的缓冲液进行三次 BAB 序列测量。保存该工作流程，并点击播放按钮运行。

接下来，使用 BAB 序列创建一个新方案，并设置包含五次测量的循环，以洗脱可逆结合的纳米抗体。保存该工作流程，然后单击播放按钮运行。将各次测量的最后一个峰电流与初始仅底物的测量结果进行比较。

如果峰值电流恢复至初始值，则表明纳米抗体已成功洗脱，初始条件已重新建立。否则，需重复操作流程或更换新的芯片。每次纳米抗体筛选应使用单独的芯片重复此过程，或者在同一芯片上依次对多个纳米抗体重复该过程。

使用任何常用的数据分析软件绘制测得的电流随时间变化的曲线。然后，软件会自动选择在加入激活缓冲液时间段内用于估算峰高的函数。根据之前仅含底物的测量结果，对峰电流以及纳米抗体的存在进行归一化处理。

将峰电流绘制在直方图中，并将仅含底物的测量值与存在纳米抗体时测得的峰电流进行比较，以鉴定出具有抑制作用的纳米抗体。取50毫升非激活性SSM缓冲液加入洁净离心管中，加入胆碱底物至终浓度为5毫摩尔，作为阳性对照的激活溶液。将5毫升非激活性溶液分别加入8个洁净离心管中，然后在各管中加入胆碱底物和抑制性纳米抗体，使其浓度处于预期IC50范围内。

向八根试管中各加入10毫升非激活溶液，并向每根试管中加入对应于非激活缓冲液的抑制性纳米抗体。启动SSM装置，测量蛋白脂质体包被芯片的电容和电导率。将不含纳米抗体的激活溶液转移至样品瓶中，并将其放入探针取样器内。

然后将不含纳米抗体的非激活缓冲液转移至储液槽中，并将其放置在芯片支架右侧的储液槽位置。将含有纳米抗体的激活和非激活溶液分别转移至样品瓶中，并将缓冲液置于探针取样器内。使用BAB序列创建工作流程的实验方案。

设置一个循环，对每种浓度测量两次，孵育120秒后，再测量三次。使用任意常用的数据分析软件，绘制电流随时间变化的曲线，并在加入激活缓冲液的时间范围内，选择合适的函数进行峰高估算。以纳米抗体浓度为横坐标，峰值电流为纵坐标作图，通过非线性回归分析确定IC50值。

为了确定纳米抗体筛选过程中所用的底物浓度，通过在不同底物浓度下测定生电性转运以确定EC50值。选择对应于饱和条件的底物浓度（5毫摩尔）作为激活缓冲液中的恒定浓度。抑制性纳米抗体对生电性转运的影响通过峰电流幅度的降低得以显现。

在运行洗涤程序以允许纳米抗体解离后，观察到初始峰值电流幅度恢复了80%至95%。当从非激活条件转换为激活条件时，这些缓冲液中存在的纳米抗体未引入显著的伪影电流。在筛选出具有抑制特性的纳米抗体后，测定了各个纳米抗体的IC50值。

用含有纳米抗体的缓冲液对芯片上的蛋白脂质体进行校准时，必须给予足够的时间。由于结合是可逆的，因此在激活和非激活缓冲液中均需存在纳米抗体。