利用邻近连接技术在不同流体剪切应力条件下可视化与定量TGFβ/BMP/SMAD信号通路

本方案使科研人员能够定量比较不同剪切应力条件下转录因子复合物的数量，对血管生物学研究具有重要意义。该方案的主要优势在于使用微流控流动通道，可同时检测多对抗体及其相应的对照组。首先，在37摄氏度下，向六通道载玻片的各通道中加入用PBS配制的0.1%猪皮明胶，孵育30分钟。

将明胶溶液中的通道排空，并在预编码的六通道载玻片中以每毫升2.5 × 10⁶个细胞的密度接种Huvecs，每通道加入30 µL M199完全培养基。将细胞置于37°C湿化培养箱中孵育1小时，使其贴壁。向每个储液池中加入60 µL预温的M199完全培养基。

将细胞在37摄氏度、加湿的培养箱中培养两天，24小时后更换培养基。将硅胶管路安装到流体单元上，向储液器中加入至少10毫升预热的M199完全培养基。用管路将流体单元连接至泵系统，并在未接种细胞的情况下进行预运行，以平衡培养基并排除残留空气。

使用串联连接管将六通道载玻片上的单个通道连接起来。将载玻片上的第一个和最后一个通道连接到流体单元上安装的管道。为了使细胞暴露于高水平的剪切应力，需逐步增加剪切应力并设置适应阶段，每30分钟以5达因/平方厘米的增量进行递增。

利用管路上的夹子在流体剪切应力处理后将载玻片从泵上取下，避免培养基在培养箱中溢出，并将流动载玻片置于冰上。在将管路从储液槽上拆下时，用手指堵住储液槽的另一端，以防止气泡进入通道。保持流动载玻片处于冰上，小心吸除储液槽中的培养基，但不要吸除细胞所在通道内的液体。

用90微升冷的无菌PBS洗涤样本，将PBS加入一个储液池，从另一个储液池小心吸出液体，然后对所有通道重复此操作。将4% PFA缓冲液90微升加入之前添加PBS的同一储液池中以固定细胞，并从另一储液池吸出液体，操作如前所述。在所有六个通道中的细胞固定完成后，将样本从冰上转移至室温，并孵育20分钟。

用 PBS 将细胞洗涤三次，向一个储液池中加入 PBS，并小心地从所有通道的另一个储液池中吸出，注意避免通道干燥。通过向其中一个储液池中加入 90 微升用 PBS 配制的室温 15 毫摩尔氯化铵溶液，淬灭残留的 PFA。从另一个储液池中吸出溶液，并将细胞孵育 10 分钟。

在空的储液槽中加入 90 微升用 PBS 配制的 0.3% Triton X-100，以对细胞进行透化处理。从每个通道的另一侧储液槽中吸液，孵育 10 分钟，然后按照之前的方法用 PBS 洗涤三次。向一个储液槽中加入 90 微升无菌 PLA 封闭溶液。

从每个通道的另一侧吸液，在湿润的孵育盒中于37摄氏度孵育一小时。将一抗加入PLA抗体稀释液中并涡旋混匀。小心地从储液池和通道中吸除封闭液。

加入一抗溶液时，立即将30微升溶液滴加到空的通道中，同时倾斜载玻片。对所有通道重复此操作，然后在湿化 chamber 中4摄氏度孵育过夜，或在37摄氏度孵育1小时。用PLA抗体稀释液将减兔（minus rabbit）和加鼠（plus mouse）PLA探针按1:5比例稀释。

加入 90 微升洗涤缓冲液 A，按所示方法清洗所有通道两次，并抽吸去除。抽吸掉洗涤缓冲液后，加入 30 微升 PLA 探针溶液，在湿化孵育盒中孵育。用去离子水将连接缓冲液按 1:5 稀释，并用稀释后的连接缓冲液将连接酶按 1:40 稀释。

洗涤并彻底抽去洗涤缓冲液A后，将载玻片倾斜，在空的通道中加入30微升连接反应液，并在湿化 chamber 中孵育。用去离子水将扩增缓冲液按1:5稀释，然后在冰上用稀释后的扩增缓冲液将聚合酶按1:80稀释。洗涤并彻底抽去洗涤缓冲液A后，将载玻片倾斜，在空的通道中加入30微升扩增溶液，并在湿化 chamber 中孵育。

将DAPI用B洗涤缓冲液按1:500稀释，向所有通道各加入90微升含DAPI的B洗涤缓冲液，如示例所示进行吸液，以染色细胞核。随后用不含DAPI的B洗涤缓冲液对所有通道洗涤一次。将B洗涤缓冲液用去离子水按1:10稀释，再用90微升稀释后的B洗涤缓冲液对所有通道洗涤一次。吸除B洗涤缓冲液后，立即向一个储液池中加入2至3滴液体封片介质，并倾斜载玻片使封片介质分布至所有通道。

将样品置于湿润环境中，于 4°C 保存，直至成像。HUVECs 经受了高和低剪切应力。低剪切应力增加了细胞质和细胞核中 SMAD 蛋白的相互作用。

单抗体对照显示无信号或极少信号，证明实验成功。增加抗体浓度可导致每个细胞的PLA信号数量增多，但高剪切应力与低剪切应力暴露细胞之间的PLA信号差异减小。自制的封闭和抗体稀释缓冲液可作为商用缓冲液的替代方案。

对商用及自制稀释液和封闭液的 PLA 事件进行定量分析，结果显示细胞质和细胞核区域的 PLA 信号模式相同。然而，使用商用溶液时，每个细胞的 PLA 事件总数更高。实验中联合使用了 SMAD Two/Three 和 SMAD Four 抗体，其中 SMAD Four 抗体不适合用于免疫荧光实验。

实验组与对照组之间的 PLA 事件无差异，表明选择正确的抗体组合以检测 PLA 事件至关重要。本方案可进行调整，用于检测除 SMAD 复合物以外的转录因子复合物之间的相互作用，从而有助于理解易发动脉粥样硬化和抗动脉粥样硬化条件下基因的调控机制。