通过荧光原位杂交技术在膀胱活检切片中可视化细菌

从一张载有去石蜡并复水的感染性膀胱活检组织切片的玻璃载玻片开始，该组织切片含有尿路致病性细菌。

引入荧光标记的通用探针——一种针对细菌16S核糖体RNA（16S-rRNA）保守区域的互补单链寡核苷酸。

在避光条件下将载玻片于较高温度孵育，以实现最佳杂交效果。

孵育期间，探针特异性地与细菌16S rRNA上的保守区杂交，使细菌呈现绿色荧光。 

杂交后，使用预热的缓冲液洗涤以去除未结合的探针。

使用Hoechst染料和荧光标记的细胞蛋白标志物对组织切片进行染色。

Hoechst 分子与 DNA 结合，将细胞核染成蓝色，而荧光标记的探针则与活检组织切片中的特定细胞成分（如黏蛋白和肌动蛋白纤维）相互作用，产生红色荧光。

清洗玻片，并向组织切片中添加封片介质。

在共聚焦显微镜下，红色荧光标记的膀胱活检切片内出现绿色荧光，证实了组织相关细菌的存在。

为每种探针准备一个加湿室：将一张浸湿并揉皱的无尘擦拭纸放入P1000吸头盒的储水槽中，并加入无菌水。将吸头架卡盒置于其上，作为载玻片的放置位置。当最终洗涤步骤完成后，从染色架中取出载玻片，将其放置在一张干净的纸巾上，组织面向上。使用无尘擦拭纸轻轻吸干载玻片，注意仅需在活检组织切片周围轻轻点吸，避免直接接触切片以吸除水分。使用疏水性笔在活检组织切片周围画出一圈边界，然后将载玻片（组织面向上）放入加湿室中。

接下来，将加湿盒放入设定为 50 °C 的培养箱中。用移液器吸取 50 至 150 µL 染色液，直接滴加在组织上方，使组织周围疏水边界所形成的矩形区域完全覆盖，然后轻轻盖上盒盖。在 50 °C 黑暗条件下过夜孵育。如果培养箱带有观察窗，需用铝箔覆盖，以创造黑暗环境。

第二天早晨，从湿盒中取出载玻片，用无尘擦拭纸迅速吸去残留的杂交液。随后将载玻片放入垂直的染色架中。将染色架置于已用铝箔包裹、内含100 ml预热洗涤缓冲液的柯林瓶中，孵育10分钟。更换新的柯林瓶和新鲜洗涤缓冲液，重复此洗涤步骤两次。

在这些洗涤步骤期间，通过将Hoechst 33342储备液按1:1,000的比例稀释于洗涤缓冲液中来配制复染液。向同一管中加入Alexa-555标记的小麦胚芽凝集素，使其终浓度为每毫升5微克，以及Alexa-555标记的鬼笔环肽，使其终浓度为33纳摩尔。避光保存，待用时取出。

最后一次洗涤完成后，将切片从考林瓶中取出，用洁净擦拭纸轻轻吸去多余的洗涤缓冲液。将切片组织面向上放置在纸巾上，在组织上直接滴加50至150微升的复染液，使疏水边界区域被完全覆盖但不溢出。用一个冷冻盒盖子覆盖最多四张切片，室温孵育10分钟。

此后，将切片放回染色架中，再用含有新鲜洗涤缓冲液的考林瓶清洗两次，每次清洗持续10分钟。然后彻底干燥切片，并将切片组织面向上放置在纸巾上，置于冷冻盒盖下方。在组织上方直接滴加一滴封片剂，轻轻盖上大小合适的盖玻片。轻压以排出任何气泡，并将加盖玻片的切片置于暗处过夜固化。次日，用一层薄薄的透明指甲油将盖玻片边缘密封至载玻片上，再于暗处干燥10分钟，随后在4摄氏度避光保存。

准备对染色的活检样本进行成像时，打开共聚焦显微镜及其配套软件。首先选择一张FISH阳性切片，并切换至计算机可视化模式。选择405、488和555通道。使用最长波长的通道（本实验中为555通道）设置针孔。随后，在488通道中找到标记细菌当前的焦平面。保持焦平面不变，调节每个通道的增益、激光功率和偏移量，确保信号不饱和且背景不过度校正。在所有三个通道中采集图像。