制备负载编码RNA适配体和核糖开关质粒DNA的多功能丝素微胶囊

本方案的意义在于，通过将DNA质粒模板固定在半透性生物相容性微胶囊中，提供了一种保持DNA编码传感器功能性的方法。所提出的DNA固定技术具有多功能性，可实现具有不同体外激活机制的多功能生物传感器的构建。

我们设想，将这些微胶囊与适当的传感元件结合，可用于研究不同的生物过程，包括在生物膜和器官等不同环境中信号分子的释放。该技术可为微尺度下的生物系统提供深入见解，特别是DNA固定化和分子拥挤如何影响基因激活的动力学与机制。首先，在牺牲性二氧化硅（SiO₂）微粒上沉积聚乙烯亚胺引发层：向含有300微升微粒的2毫升微量离心管中加入1毫升聚乙烯亚胺溶液。

在室温条件下，将混合物置于ThermoMixer上以800转/分钟的速度振荡。在室温下以0.2 ×g离心1分钟收集微粒，并小心移除上清液。15分钟后，用1毫升无DNase和RNase的去离子水对微粒进行4次洗涤，每次洗涤在室温下以0.2 ×g离心1分钟，并在每次离心后弃去上清液。

接下来，用无DNase和RNase的去离子水将DNA质粒的浓度调整至每微升50至200纳克，并取1毫升制备好的溶液将DNA沉积到聚乙烯亚胺预处理的微粒上。在4摄氏度、800 rpm条件下，用ThermoMixer轻轻振荡微粒混合物15分钟，然后在0.2 ×g离心1分钟收集微粒。标记试管：编码茶碱核糖开关并偶联GFPa1的DNA质粒标记为ThyRS-GFPa1，编码Broccoli适体的DNA质粒标记为BrocApt。

小心移除上清液，然后用一毫升无 DNase 和 RNase 的蒸馏水将微粒洗涤四次，每次离心后弃去上清液，操作方法如前所述。为沉积丝素蛋白层，向吸附了 DNA 的微粒中加入一毫升重建的水相丝素蛋白溶液，在 ThermoMixer 上以 750 转/分钟轻轻涡旋振荡 15 分钟，温度为 10 摄氏度。通过离心收集微粒，然后用一毫升无 DNase 和 RNase 的蒸馏水洗涤一次，操作方法如前所述。

重复离心，并弃去上清液。加入0.5毫升经蒸馏的DNase和RNase水溶液，通过涡旋振荡混合微粒。然后，在ThermoMixer上用0.5毫升100%甲醇于10摄氏度处理微粒5分钟。

离心收集微粒后，在 ThermoMixer 上以每分钟 750 转的速度用 100% 甲醇在 10 摄氏度下处理 10 分钟，以形成 β-折叠结构。在 4 摄氏度下以 0.2 ×g 离心 1 分钟，收集微粒，随后用 1 毫升无 DNase 和 RNase 的蒸馏水洗涤微粒两次，方法如前所述。通过向沉淀的核壳微粒中加入 8% 氢氟酸溶液，溶解微粒中的 SiO₂ 核心。

将溶解的颗粒溶液转移至透析装置中，并在烧杯中用去离子水进行透析。然后，使用1 mL移液器将透析装置中的丝素蛋白微胶囊悬浮液收集到新的2 mL微量离心管中。取100 µL微胶囊样品加入八孔腔室载玻片的单个孔中，在使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像前，静置20至30分钟使胶囊沉降。

用移液器将100微升胶囊悬浮液加入玻片培养皿的每个孔中。随后，依次向每个孔中加入300微升不同分子量的荧光染料溶液，从最低分子量到最高分子量逐步添加。通过反复吹打混匀混合液，并在室温下孵育1小时，直至荧光染料溶液的扩散达到平衡。

随后，将载玻片转移至共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），使用100倍油镜物镜，以488纳米激发波长对每个孔进行成像。通过调节焦平面确定感兴趣区域，并聚焦于呈现最大直径圆形的微胶囊。依次向微胶囊样品中加入无细胞组分，进行体外转录/翻译反应，并将反应管在30°C下孵育4小时。

使用488纳米的激发波长，并在约510纳米的GFP/FITC滤光片下通过酶标仪检测荧光。最后，使用488纳米和561纳米激光在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）系统上对丝素蛋白微胶囊进行成像。在该研究中，制备了具有均一尺寸（约4.5微米）和约500纳米壳层厚度的稳定丝素蛋白微胶囊。

通过分子量截留法分析了中空丝素蛋白微胶囊壳的渗透性。聚乙烯亚胺引物层浓度的增加可提高微胶囊的胶体稳定性，并使其壳层更具渗透性；而去除引物层则导致壳膜渗透性降低的微胶囊发生聚集。在ThyRS激活过程中，绿色荧光蛋白a1（GFPa1）的表达动力学显示，装载于丝素蛋白微胶囊内的DNA质粒相较于未包封的对照组DNA，能够实现更高的GFPa1基因激活水平。

在代表性分析中，展示了每个胶囊载有32个DNA拷贝的丝素蛋白胶囊在体外转录和翻译系统中孵育前后共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。丝素蛋白胶囊的横截面强度分布图显示了GFPa1的表达。比较了每个胶囊载有30个DNA拷贝的20层丝微胶囊与未包封DNA对照组的转录动力学。

与相同浓度的非包封DNA样品相比，丝素微胶囊产生的信号更强，证实了丝素微胶囊的有效性。按照本方案，可采用多种高分辨率显微技术对固定状态下的DNA缠结现象以及体外解耦的基因激活过程进行成像。该技术可用于研究最小人工细胞中分子水平的动力学过程。

具体而言，当与适当的基因元件结合时，这些微胶囊可用于研究细胞间通讯。