细胞挤压作为一种稳定且基于微流控的细胞内递送平台

坠落实验的总体目标是通过机械破坏的方式，将大分子无载体地递送至靶细胞。该过程首先将靶细胞与所需的递送材料混合成悬液，并装入特制微流控装置的储液腔中。第二步，对微流控装置加压，使细胞在压力驱动下流经一组微流控通道，通道的狭窄结构会挤压细胞，从而实现细胞膜的瞬时可逆性破坏。

接下来，让细胞在目标递送材料存在的情况下孵育，以促进该材料扩散进入细胞质。在此期间，细胞膜得以修复。通过流式细胞术获得的结果显示，大分子已成功递送。

与现有方法（如转染和脂质体转导）相比，该技术的主要优势在于能够处理其他方法无法有效递送的具有挑战性的细胞类型和材料。该方法可解答生物学领域的关键问题，例如如何提高细胞重编程效率。该技术的应用前景涵盖癌症的治疗与诊断，因为该系统能够操控免疫细胞，从而增强其抗肿瘤功效。

首先，制备或购买此处所示的微流控装置、装置支架、塑料流体储液池和O型圈（具体细节见随附的文字版实验方案），然后将三个可密封容器部分装满70%乙醇。将装置放入第一个容器中，储液池和O型圈放入第二个容器中，支架放入第三个容器中。随后，将三个容器剩余空间完全用70%乙醇填满。

接下来，将装有储液池和O型圈的容器以及装有支架的容器在超声波清洗仪中处理5至10分钟，使用前完成此步骤。这有助于去除之前实验残留的任何污染物颗粒，同时在生物安全柜中用70%乙醇擦拭工作区域。然后，用70%乙醇擦拭所有所需材料，包括三个容器和一对镊子，进行消毒，并将其放入生物安全柜中，准备开始组装。

首先，在工作区域放置两到三张低绒擦拭布。然后用镊子将乙醇容器中的塑料储液槽取出，并将其置于擦拭布上，以促进储液槽内表面乙醇的毛细渗透和蒸发。轻轻敲击储液槽，以帮助去除其中的乙醇溶液。

如有必要，使用加压气体将储液池彻底吹干。待储液池干燥后，将O型圈插入储液池相应的槽位中。然后用镊子将芯片正面朝上放入装置支架中。

确保芯片平整地放置在支架中，必要时使用镊子进行调整。如果芯片无法正确安装到支架中，则在后续步骤中存在损坏的风险。接下来，轻轻将储液池放置在支架上，并与卡扣对齐。

确保O型圈不会从其槽位中脱落。在此过程中，轻轻按压储液池，直到它们卡入正确位置。确保储液池两侧均已固定到位，且芯片处于正确位置。

切勿用力按压储液池，因为压力可能导致芯片破裂，影响原代细胞或贴壁细胞的培养。对于细胞系，应在实验前一至两天接种细胞，使其汇合度不超过80%。

实验当天，在实验开始前立即收集细胞，并将细胞重悬于培养基或其他所需的缓冲液中，浓度为每毫升100万至1000万个细胞。然后小心地将细胞悬液通过40微米的细胞筛网，以防止细胞团块和基质堵塞装置。

过滤后，取300微升细胞悬液，与所需浓度的递送材料在另一试管中混合。本实验中，每50微升细胞悬液加入5毫克/毫升的葡聚糖溶液2微升和Alexa 488同型对照抗体2微升。

接下来，用移液器轻轻吹打混合100微升细胞。然后使用凝胶加样枪头，将细胞和递送材料移入其中一个储液槽中，将压力管连接到已填充的储液槽上，并用手指拧紧结以确保密封良好。随后调节调压阀上的气压至70 PSI，以控制细胞通过装置的速度。

应针对每个实验中使用的特定细胞和微流控芯片组合优化压力。一切准备就绪后，将装置升至与视线齐平的位置，并调整方向，使储液池中的液体清晰可见。然后按下按钮阀，对储液池加压，启动细胞流动。

观察液体从储液器流出的速度。如果液体流速相较于初始流速明显减慢，则表明安装的装置可能已堵塞，需要更换。堵塞引起的剪切力增加将导致高于正常水平的细胞死亡。

当液面距离储液槽底部约两毫米时，迅速将调节器调至零 PSI 以停止液体流动。必须在储液槽排空之前停止气流，否则样品可能会被喷出收集储液槽。随后，从流出储液槽中收集处理后的细胞，并将其转移至微量离心管中。

在室温下，这些转染细胞将持续摄取物质长达10分钟。10分钟后，可根据实验需求向细胞中加入额外培养基进行培养，或直接继续后续实验操作。重复上述步骤以收集所需数量的处理细胞；若芯片发生堵塞，可按需更换芯片，并在每个后续样本实验中丢弃已堵塞的C型装置。

改变流动方向以尽量减少堵塞效应。收集细胞完成后，轻轻拨开夹具臂，将储液池从主支架上拆下。然后将需要重复使用的各部件放入相应的储存容器中，并用新鲜的70%乙醇充满。

最后，将所有使用过的芯片放入单独的容器中，以进行妥善处理。检测了HeLa细胞的递送效率和细胞活力。经过一系列实验，测试了三种不同的微流控芯片，在最高达600毫米每秒的不同流速范围内进行了评估。

这些测试结果表明，对于所测试的每种芯片，提高流速均能改善荧光标记的三千道尔顿葡聚糖向细胞内的递送效果。此外，流速提高还导致测试装置中细胞活力下降约20%。该程度的细胞死亡相对较低，远低于设计不当的装置中常见的细胞死亡水平。

左侧所示对照细胞群体对太平洋蓝标记的葡聚糖的摄取，主要是由于有限的表面结合和内吞作用所致。这些细胞与处理组细胞暴露于递送材料的时间相同。右侧为在暴露于与对照组相同浓度的葡聚糖条件下，通过微流控装置的活细胞群体。

阴影区域内的细胞被视为未递送，而该线条右侧的细胞则被定义为已递送。一旦掌握，若操作得当，该技术可在一小时之内完成。在完成此操作后，还可进行其他方法，如生活期后验光检查，以在该技术开发后进一步回答递送效率和材料功能等方面的问题。

该技术为再生医学领域的研究人员探索利用直接蛋白递送对成年个体细胞进行细胞编程铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何针对所需应用建立并操作自挤压系统。