用于鉴定与固定化原肌球蛋白激酶受体B相互作用的特化植物代谢物的细胞膜亲和色谱柱

本视频展示了组装具有功能性跨膜受体的细胞膜亲和层析柱的关键步骤。此类层析柱可用于鉴定复杂提取物中与固定化跨膜受体相互作用的小分子。细胞膜亲和层析柱可加速从复杂混合物中鉴定生物活性化合物的过程。

细胞膜亲和色谱柱的使用对于致力于鉴定复杂天然基质（如植物、真菌或细菌提取物）中具有药理活性化合物的研究者而言具有特殊意义。首先，通过将120毫克的苯甲脒溶解于5毫升超纯去离子水中，配制200毫摩尔的苯甲脒储备液。在通风橱中，将0.017克PMSF溶解于10毫升乙醇中，配制10毫摩尔的PMSF储备液。

通过将市售的蛋白酶抑制剂混合物溶解于1毫升超纯去离子水中，配制100倍蛋白酶抑制剂混合液。充分混匀后，分装成200至300微升的等份。通过将55.114毫克三磷酸腺苷二钠盐水合物溶解于1毫升去离子超纯水中，配制100毫摩尔的ATP储存液。

充分混匀后，取100微升该混合液进行分装。通过将3.03克Tris-HCl、2.9克氯化钠、0.22克无水氯化钙、0.2克六水合氯化镁以及0.19克氯化钾溶解于500毫升超纯去离子水中，制备缓冲液。通过将17.3毫升Tris缓冲液与0.3毫升苯甲脒储备液、0.2毫升PMSF储备液、0.2毫升蛋白酶抑制剂混合液、20微升ATP储备液、2毫升甘油以及0.029克EDTA混合，制备匀浆缓冲液。

使用盐酸溶液将 pH 调至 7.4。在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟收集细胞，弃去上清液，并用 10 毫升预冷的 1× PBS（pH 7.4）洗涤剩余的细胞沉淀。弃去上清液，加入 20 毫升匀浆缓冲液。

将锥形管置于冰上。将细胞悬液转移至40毫升Dounce玻璃匀浆器中，在冰上手动匀浆，使用研杵上下研磨40次。将匀浆后的细胞悬液转移至50毫升锥形管中，弃去沉淀，将上清液转移至新的锥形管中。

保存细胞膜沉淀，弃去上清液。通过将8.7毫升缓冲液与0.1毫升PMSF储备液、0.15毫升苯甲脒储备溶液、0.1毫升蛋白酶抑制剂混合物、10微升ATP储备溶液、1毫升甘油和0.2克胆酸钠混合，制备溶解缓冲液。将溶解缓冲液转移至含有细胞膜碎片的锥形管中。

重悬沉淀。将所得混合物在4°C、150 RPM条件下旋转孵育18小时。18小时后，在4°C、47,900 × g条件下离心溶解混合物30分钟。

向上清液中加入 100 毫克 IAM. PC.DD2 颗粒，在 4°C 条件下以 150 转/分钟旋转孵育一小时。在 4 升超纯去离子水中加入 24 克 Tris-HCl、23.4 克氯化钠、0.06 克氯化钙、5.85 克 EDTA 和 0.07 克 PMSF，配制透析缓冲液。

先将 PMSF 溶于少量乙醇中，然后缓慢加入含有缓冲液的烧杯中。剪取 10 厘米长的纤维素透析膜以制备透析管，将含有 IAM 的悬浮液、PC.DD2 颗粒和细胞膜碎片转移至透析管中。

用透析管夹将透析管两端封闭。将透析管放入透析缓冲液中。24小时后，将透析管转移至新配制的透析缓冲液中，继续透析24小时。

通过将0.778克乙酸铵溶解于1升超纯去离子水中，制备用于洗涤IAM.PC.DD2颗粒以及柱表征实验的10毫摩尔、pH 7.4的乙酸铵缓冲液。透析48小时后，从透析缓冲液中取出透析管，并将透析管内的内容物转移至15毫升锥形管中。

弃去上清液，再用10毫升醋酸铵缓冲液将剩余沉淀洗涤三次。第三次洗涤后，将剩余沉淀重悬于1毫升醋酸铵缓冲液中。充分混匀，并将所得悬液用于填充5 × 20玻璃柱，制备CMAC层析柱。

装柱时，将预先用醋酸铵缓冲液浸泡过的底部滤膜放入滤膜架中。将滤膜架安装到玻璃柱中，并拧紧柱帽以固定滤膜架的位置。将色谱柱垂直放置于手指夹中，并固定在实验架上。

将一个烧杯置于柱子下方，用单通道移液器将少量浆液缓慢转移至玻璃柱中，移液时将移液器吸头紧贴玻璃柱管壁。为加快装柱过程，可在每步操作间隙用微量移液器吸除固定相床面上方的缓冲液。放置上端滤膜，并拧紧适配器单元，确保固定相上方无残留缓冲液。

使用适配器锁固定适配单元的位置。将色谱柱连接至高效液相色谱泵，并用乙酸铵缓冲液以每分钟0.2毫升的流速冲洗色谱柱过夜。对于长期保存，使用含0.05%叠氮化钠的乙酸铵缓冲液冲洗色谱柱，在操作叠氮化钠时需穿戴实验服、护目镜和手套，并在4°C下保存。IAM。

将固定有神经母细胞瘤 TrkB 细胞膜片段并在存在 BDNF 的情况下孵育的 PC.DD2 颗粒产生了荧光信号。而在包裹 TrkB 缺失细胞膜的 IAM 颗粒中，或在未添加 BDNF 的 TrkB 细胞膜包裹的 IAM 颗粒中，均未观察到荧光。图中显示了功能化 CMAC 柱对固定化 TrkB 受体进行前缘亲和色谱分析的典型图谱，依次上样 7,8-DHF 的浓度分别为 1 毫摩尔、750 纳摩尔、500 纳摩尔和 300 纳摩尔，结果显示保留时间随浓度增加而发生依赖性变化。

一个无功能的CMAC柱显示出标记配体的保留无浓度依赖性变化。通过固定不表达靶蛋白的细胞膜片段，制备了CMAC阴性对照柱，以排除非特异性相互作用。加入0.2%的积雪草水提取物后，7,8-二羟基黄酮（7,8-DHF）的保留显著降低，表明存在与激动剂结合位点竞争的配体。

7,8-二羟基黄酮（7,8-DHF）在CMAC阴性TrkB空柱上的保留未发生减少，进一步证实该柱上无功能性TrkB受体。缺失峰色谱法鉴定出一种在TrkB柱上强保留、而在TrkB空柱上较早洗脱的化合物，表明其存在特异性相互作用。了解用于快速细胞膜亲和色谱柱的受体来源至关重要。

务必查阅相关文献以正确设计匀浆和溶解缓冲液。本方案中制备的细胞膜亲和层析柱可用于鉴定新的潜在药物候选分子，并表征固定化受体与其天然配体之间相互作用的性质。