将革兰氏阴性菌细胞包膜分离为内膜和外膜组分的技术方法及对Acinetobacter baumannii的优化调整

研究微生物如何调控各双分子层的化学组成，将有助于我们深入了解抗生素杀菌机制、抗菌耐药性以及疾病发病机制。该技术无需使用去污剂，即可将革兰氏阴性菌的细胞包膜分离为两个明确的组分，因此可在接近天然的环境中对脂质、蛋白质和糖类进行分析。

某些步骤具有时间依赖性，需要集中注意力并协调操作。最初可使用一至两个样本，待操作熟练程度提高后，再逐步增加样本数量。

每次处理的样本不应超过六个。本实验为多日操作流程，设置视觉检查点有助于评估实验效果与操作误差。在执行某些最终步骤之前，需做好相应准备。

从冻存的甘油菌种中挑取细菌，在新鲜的琼脂平板上划线。待菌落生长后，将平板置于4°C保存。挑取单个菌落接种于装有5 mL液体培养基的离心管中，根据需要过夜培养细菌。

将过夜培养的细菌培养物用一升优选的肉汤培养基进行回稀释，并将烧瓶进行培养。当达到所需的光密度时，将烧瓶从培养箱中取出并置于冰上。在600纳米处测定培养物的光密度，并计算相当于六至八乘以十的十一次方个细菌菌落形成单位的培养物体积。

将此体积的培养物加入离心管中，并确保其余培养物在使用前保持在冰上。在固定角度、高速离心机中，于 7,000 至 10,000 ×g 及 4 °C 条件下离心 10 分钟，使细菌沉淀。小心倾去上清液并弃去。

将每份细胞沉淀重悬于12.5毫升缓冲液A中。向细胞悬液中加入一个磁力搅拌子。向每份细胞重悬液中加入180微升浓度为10毫克/毫升的溶菌酶。在通过离心收集经溶菌酶和EDTA处理的细菌后，迅速向细菌中加入蛋白酶抑制剂、氯化镁和核酸酶，并立即用缓冲液B重悬细胞。保持悬液在冰上，搅拌2分钟。

接下来，向每份细胞重悬液中加入 12.5 毫升 1.5 毫摩尔的 EDTA 溶液，继续在冰上搅拌 7 分钟。将悬液倒入 15 毫升锥形管中。在 4°C 条件下，以 9,000 至 11,000 ×g 离心 10 分钟。

将上清液弃入生物危害废物容器中，并将沉淀物保留在冰上。向每份细胞沉淀中加入25毫升缓冲液B。然后，加入55微升1摩尔的氯化镁、1微升RNase/DNase/核酸酶试剂以及1微升蛋白酶抑制剂混合物。

将沉淀重悬于混合液中。充分吹打并涡旋振荡，直至溶液呈现均匀状态。将悬液置于冰上保存。

将样品倒入匀浆器样品筒中，并将压力升至20,000 PSI。为避免病原体气溶胶化，在加入细菌悬液前，先用缓冲液B对加压装置进行预处理，并调节压力水平。启动压力腔，并作为预防措施，加入10毫升缓冲液B。

将细胞裂解液收集到50毫升锥形管中，置于冰上，同时保持样品处于冰上。为实现完全裂解，重复此过程三至五次。为沉淀残留的完整细胞成分，将裂解后的细菌样品在4°C、6,169 × g条件下离心10分钟。

将现在含有匀浆化膜的上清液分装至聚碳酸酯管中，用于超速离心。在4°C条件下，以184,500 × g离心细胞裂解物至少1小时。弃去上清液，将膜沉淀物保留在冰上。

使用玻璃Dounce匀浆器，将膜沉淀物重悬于1毫升低密度等密度蔗糖梯度溶液中。然后，用玻璃巴斯德吸管将样品匀浆液转移至1.5毫升微量离心管中，并将管子置于冰上。为制备蔗糖梯度，将聚丙烯或超透明开口离心管保持轻微倾斜的位置。

缓慢加入两毫升高密度蔗糖溶液。然后加入四毫升低密度蔗糖溶液。制备密度梯度时，应缓慢加入蔗糖溶液，以避免各层混合。

蔗糖层应略微可见，且整体界限清晰。接下来，加入先前用1 mL低密度等密度蔗糖溶液重悬的总膜组分。最后，加入约6 mL低密度等密度蔗糖梯度溶液，补满离心管的剩余部分。

使用水平转子在 288,000 × g 和 4 °C 条件下超速离心样品 16 至 23 小时。从 P1000 移液器吸头尖端约五毫米处剪去末端。离心结束后，用移液器去除管中上层的棕色部分。

将含有内膜组分的这一层转移至聚碳酸酯离心管中，用于超速离心。保留约两毫升位于53%蔗糖与73%蔗糖界面之上的蔗糖溶液，以确保下方白色的外膜组分不会污染内膜组分。再次使用剪去末端的P1000移液枪头，移除外膜层，并将其转移至另一聚碳酸酯离心管中。

用分离的膜储存缓冲液填满聚碳酸酯瓶中的剩余空间，并通过倒置或移液混匀。将样品置于冰上保存。为收集膜，需在4°C条件下，以184,500 × g离心聚碳酸酯瓶1小时。

最后，弃去上清液，加入 500 至 1,000 微升储存缓冲液。通过 Dounce 匀浆器重悬膜组分，将样品收集至 2 毫升微量离心管中。

将总膜沉淀物刮下后，使用Dounce匀浆器匀浆，并在蔗糖密度梯度上进行超速离心，以分离内膜和外膜。对于某些细菌菌株，20%–53%–73%的蔗糖密度梯度足以实现分离；但对于鲍曼不动杆菌（A. baumannii），该梯度无法有效分离，而采用20%–45%–73%的梯度可成功实现分离。

为了评估分离效率，对膜样品进行了NADH脱氢酶检测，该酶位于细菌内膜中。在340纳米处光密度的降低表明该酶的存在。测定野生型S.typhimurium、E.coli K12 DH5a和galE突变型S.typhimurium的内膜和外膜组分各50微克样品的光密度。

在检测鲍曼不动杆菌膜组分纯度时，使用了更高浓度的蛋白，因为初步实验表明，当使用50微克蛋白时，鲍曼不动杆菌的NADH脱氢酶相对水平低于其他细菌菌株。为评估内膜组分与外膜组分之间的交叉污染，提取并可视化了脂多糖（LPS）和脂寡糖（LOS）。将提取物上样至聚丙烯酰胺凝胶，并用Pro-Q Emerald 300染色。

鲍曼不动杆菌是一种高度优先关注的多重耐药人类病原体。本实验方案有助于研究人员理解脂寡糖、磷脂和脂蛋白在这一独特且重要病原体的耐药性及毒力机制中的作用。该方法适用于对革兰氏阴性菌双层膜中常见的磷脂、糖脂类碳水化合物、蛋白质及小分子进行后续分析。