使用荧光辅助碳水化合物电泳（FACE）方法测定糖原的葡聚糖链长度分布

该方法有助于更好地理解糖原颗粒的结构组织。这一问题至关重要，因为葡聚糖链的数量，即所谓的链长分布，决定了糖原颗粒的理化性质，例如水溶性。

该技术的一个主要优势在于，荧光强度不随葡聚糖链长度的变化而改变。每个葡聚糖分子仅结合一个APTS分子，因此荧光强度与葡聚糖链的数量成正比。

辅助毛细管电泳技术领域适用于解析糖原代谢酶的医学机制。例如，我们可以确定分支酶将葡聚糖链转移至受体葡聚糖上后，其聚合度的变化情况。该反应必须在特定条件下进行。

因此，必须保护区域免受湿气影响。将200微升浓度为0.5–2毫克/毫升的纯化糖原与200微升pH 4.8的100乙酸缓冲液混合。加入2微升异淀粉酶和1.5微升普鲁兰酶。

用移液器轻轻吹打混匀。然后在1.5毫升离心管中于42摄氏度孵育16小时。于95摄氏度孵育5分钟以终止反应。

在室温下以16,100 × g离心5分钟，使不溶性物质沉淀并去除。用移液器移除上清液，并将其转移至新的标记管中。将树脂珠加入空的微量离心管后，通过加入相当于100 µL的阴离子阳离子交换树脂珠对上清液进行脱盐处理，并进行振荡混匀。

用移液器收集样品，并将其放入新的标记管中。将样品冷冻干燥。将干燥后的样品在室温或 20 摄氏度下保存。

将干燥的样品与2微升1摩尔氰基硼氢化钠和四氢呋喃，以及2微升8-氨基-1,3,6-芘三磺酸混合，在避光条件下42摄氏度孵育16小时。向每个样品中加入46微升超纯水。

为将样品稀释50倍，取1微升样品加入含有49微升超纯水的100微升微量离心管中。涡旋混匀。在设定仪器界面的同时，将样品置于避光环境中静置5至10分钟。

进行反向电泳时，设置方法参数，将进样压力设为 0.5 磅力每平方英寸。然后将极性设为反向模式以进行分离。用超纯水将 N-连接糖类分离缓冲液稀释至原浓度的三分之一。

在裸熔融石英毛细管中，使用稀释缓冲液于30千伏条件下进行APTS标记葡聚糖的分离。然后设定进样时间并开始分析。导出包含电泳图谱轮廓的ASC文件和包含积分数据的CDF文件。

打开 ASC 文件，根据时间图绘制相对荧光单位。打开 CDF 文件，进行首次自动积分，并使用峰谷到峰谷积分方式和最小面积调整以下参数。

手动检查并校正任何不正确的整合事件。在 4.13 至 4.67 分钟之间观察到的荧光信号来源于未反应的 APTS。标记的麦芽六糖（DP 6）的阿留申时间估计为 8.49 分钟。

根据DP 6的Aleutian保留时间，鉴定出APTS标记的牛糖原葡聚糖。在未与去分支酶孵育的糖原对照样品中，未检测到游离麦芽寡糖。插图显示了长度达44个葡萄糖单位（DP）的葡聚糖链的分离结果。链长分布以每个DP所占的百分比表示。平均链长通过将每个百分比链长乘以其相应的聚合度后求和计算得出。

面部分析显示，麦芽糖和兔肝中含量最丰富的葡聚糖是麦芽糖，牡蛎中为麦六糖，牛肝中为麦七糖。利用面部分析测定了从野生型和突变型蓝细菌菌株中纯化的糖原的链长分布。通过从各突变体每种聚合度（DP）的百分比中减去野生型相应DP的百分比，进行差减分析。

根据每种链长分布（CLD）中观察到的最大峰，对来自集胞藻（Synechocystis）野生型及突变体的糖原平均链长分布进行了归一化处理。该技术有助于更深入地理解与糖原代谢缺陷相关的人类疾病，特别是 Andersen 病，该病源于细胞内异常糖原颗粒的积聚。