基于原子力显微镜悬臂的纳米压痕技术：在空气与液体环境中进行纳米尺度力学性能测量

原子力显微镜（AFM）悬臂梁式纳米压痕技术可用于测定多种材料在空气和液体环境中从千帕到吉帕范围内的纳米级力学性能，例如弹性模量。基于AFM悬臂梁的纳米压痕技术能够在多种材料及相关环境条件下，实现纳米级精度和分辨率的共定位形貌成像与原位定量力学性能测量。该技术可用于区分具有不同力学特性的健康与病变结构、组织或细胞。

准确确定悬臂梁式纳米压痕过程中针尖与样品的接触面积以及所施加的力，需要对原子力显微镜（AFM）探针进行仔细校准，这对于定量测量纳米尺度的力学性能至关重要，尽管具有挑战性。首先，根据介质、预期模量、样品表面形貌及相关的特征尺寸，选择适用于目标样品纳米压痕的合适原子力显微镜（AFM）探针。将探针装载到探针 holder 上，并将探针 holder 安装至 AFM 扫描头。

在AFM软件中选择合适的纳米压痕模式，该模式应允许用户控制各个斜坡。将激光对准探针尖端相对一侧的探针悬臂背面，并将其对准位置敏感探测器（PSD）。通过最大化总电压，将激光光斑中心调整至悬臂背面中央位置。

接下来，通过调整垂直和水平偏转信号，使反射激光束光斑在位置敏感探测器（PSD）上的位置居中，尽可能接近零，从而为系统提供最大的可检测偏转范围，以产生与悬臂偏转成正比的输出电压。对探针原子力显微镜（AFM）系统的偏转灵敏度（DS）进行校准。为此，需在蓝宝石样品上设置并执行DS校准压痕，使探针偏转程度与计划在样品上进行的压痕大致相同，因为测得的位移依赖于针尖偏转角度，并在大偏转时呈现非线性。

重复该斜坡过程五次。根据力-位移（FD）曲线中初始接触点之后接触区域线性部分的斜率，确定悬臂的位移灵敏度（DS），单位为纳米每伏特（nm/V），或光杠杆灵敏度的倒数，单位为伏特每纳米（V/nm）。为获得最高准确度，使用多次测量值的平均值。

如果相对标准偏差超过1%，则需重新测量DS，因为最初几个力-距离（FD）曲线可能由于粘附力的初始引入而不理想。如果探针悬臂的弹簧常数K未经厂家校准，则需校准弹簧常数。如果探针未提供厂家校准的针尖半径测量值，应测量有效针尖半径R。若采用盲法针尖重构方法，应使用较慢的扫描速率和较高的反馈增益对针尖表征样品或粗糙度样品成像，以优化对极尖锐特征的追踪效果。

根据预期的针尖半径选择图像尺寸和像素密度。接下来，使用原子力显微镜（AFM）图像分析软件对探针针尖进行建模，估算其末端半径以及在预期样品压入深度下的有效针尖直径。完成探针校准后，在软件中输入DS、K和R值。

最后，输入样品泊松比的估计值，以将测得的约化模量转换为实际的样品模量。如果采用基于针尖形状和压痕深度的圆锥形或锥球形接触力学模型，则需要输入针尖半角。移动样品至原子力显微镜（AFM）探头下方，并定位到目标区域进行检测。

监测垂直偏转信号，或执行小幅初始斜坡扫描，以确认针尖与样品是否接触。轻微向上调整原子力显微镜（AFM）探头位置，再次进行斜坡扫描。重复此过程，直至针尖与样品恰好脱离接触，表现为斜坡曲线几乎平坦，且悬臂的垂直偏转极小。

当无明显探针与样品相互作用时，将原子力显微镜（AFM）探头下降约等于 ramp 尺寸 50% 的距离，以确保在手动移动 AFM 探头时探针不会撞击样品。再次进行 ramp 操作，重复此过程直至观察到良好的曲线。调整 ramp 参数。

根据样品和所需的压痕深度选择合适的斜坡尺寸。然后选择合适的斜坡速率。对于大多数样品，1 Hz 是一个良好的起始点。

设置每个斜坡的样品数量，以实现测量所需分辨率。设置X轴旋转，以便在Z方向压入的同时轻微移动探针的X方向，从而减少样品和探针上的剪切力。X轴旋转的数值应等于探针支架相对于表面法线的偏移角度。

接下来，选择使用触发式或非触发式斜坡加载。如果选择触发式斜坡加载，则设置触发阈值，以实现对样品所需的压入深度。在选定位置进行压痕操作。

在软件中选择并加载待分析的数据。输入校准后的弹簧常数、DS（或倒光学杠杆灵敏度）和探针针尖半径值，并提供样品泊松比的估计值。根据针尖和样品的特性，选择合适的纳米压痕接触力学模型。

运行拟合算法。检查力-距离（FD）曲线的拟合情况。残差误差较小且平均R平方值接近1时，表明数据与所选模型拟合良好。

如有需要，可抽样检查单个力-距离曲线，以直观评估曲线形态、模型拟合情况以及计算得到的接触点。图中展示了在空气中对经树脂包埋的火炬松样品、以及在磷酸盐缓冲盐水溶液中对间充质干细胞核获得的接近理想的力-距离曲线。使用硅探针时，探针尖端在整个成像过程中相对于其初始 pristine 状态出现了显著磨损。

随着每一张后续图像的获取，探针尖端逐渐变得更加圆钝。与金刚石探针相比，在盲尖重建方法的检测极限内，其尖端半径未发生改变，突显了金刚石极高的耐磨性。此处展示的是覆盖多个细胞的原子力显微镜形貌图像，包含伪三维呈现方式，以及对应的火炬松样品的模量图。

在获取原子力显微镜（AFM）图像的同时生成的AFM模量图显示，图像中心的矿物包裹体显著硬于周围的有机基质。图中展示了探针针尖半径和形状对Bakken页岩样品高纵横比特征形貌的影响。基于悬臂梁的纳米压痕实验对间充质干细胞及分离细胞核进行测试，结果显示两者在弹性模量上无统计学差异。

本文展示了利用原子力显微镜（AFM）研究含胆固醇脂质双层的形态学特征和机械性能。准确的纳米力学测量依赖于探针的正确校准以及在接触力学模型中选择合适的扫描参数。除了能够实现弹性模量测量外，基于AFM悬臂梁的纳米压痕技术还可用于探测磷脂双层在生理相关条件下的破裂强度或穿透力。

基于原子力显微镜悬臂梁的纳米压痕技术已使得研究人员能够探究结构基因敲除、药物处理以及低强度振动（用以模拟运动）对间充质干细胞核力学特性的影响。