解决基于原子力显微镜的人类关节软骨离体组织微压痕实验中的实际问题

本实验方案的目标是建立一种体外模型，用于研究骨关节炎发生和发展过程中关节软骨的力学特性。该技术的主要优势在于，软骨组织块易于制备，且能高度代表天然年龄软骨。该模型可用于在生物力学层面分析和监测多种骨关节炎相关诊断和治疗方法。

首先，使用解剖刀将软骨从骨头上切割下来。使用活检打孔器，制备直径为4毫米的软骨圆片。将圆片放置在自制的切割装置上。

使用刮刀固定并稳定软骨圆盘。用剃刀片切割软骨圆盘。使用刮刀收集圆盘并将其放入一个 1.5 毫升离心管中。

为了使荧光染料保留在软骨样本中，向96孔板的每个孔中加入130微升细胞通透性荧光染料，并将组织圆片分配至各孔中，每孔一个圆片。将96孔板放置在荧光显微镜的载物台板架上。选择合适的荧光滤光片和物镜。

将物镜置于预先选定的含有单个软骨的孔下方。聚焦于软骨片以观察细胞排列模式。选择导航功能以获取整个孔的概览。

使用鼠标左键拖动以导航至不同的视野位置。选择一个包含待扫描目标区域的方框。选择软件的“聚焦图点”选项，然后通过在每个 Tile 中心位置单击鼠标左键来逐一选择各个 Tile。

在出现的窗口中选择“焦点图”选项，该窗口包含所有先前选定的图块。双击某个图块以显示并将其调至合适的焦距。接下来，单击“设置Z”以保存焦平面，然后继续处理下一个图块。

调整每个单独图块的焦平面后，按下“开始扫描”以开始图像采集。在培养皿中固定每个预选的含有细胞图案的软骨圆片时，需在圆片的顶部、底部、左侧和右侧添加足量的生物相容性胶水。用 2.5 毫升不含 L-谷氨酰胺的 Leibovitz 培养基覆盖圆片。

将培养皿放置在原子力显微镜（AFM）设备的样品台上。为校准AFM悬臂梁，将其置于玻璃块悬臂梁的表面，使其位于玻璃块中心的抛光光学平面上。使用步进电机功能以100微米为步长逐步降低悬臂梁，直至其完全浸入介质中。

为了确定所需的软骨测量位点，首先在培养皿的洁净无样品区域启动扫描探针。然后将悬臂从培养皿底部回撤1.5毫米。切换至荧光观察模式，并通过视觉识别椎间盘的顶部位置。

将原子力显微镜样品台精确向圆盘中心移动两毫米。运行扫描仪进近程序，以接触软骨圆盘表面，并将悬臂回缩100微米。为生成力-距离曲线，需聚焦于目标测量位置处的细胞。

单击运行按钮以开始测量，并在每个测量位点获取五条力-距离曲线。检查曲线后将其保存。为估算杨氏模量，请使用“打开一批光谱曲线”选项，载入生成的力-距离曲线进行分析。

选择赫兹-拟合模型，然后选择弹性-拟合选项。接着可视化并记录杨氏模量。使用0.5的泊松比以及合适的悬臂梁针尖半径进行调整。

然后目视检查力-距离曲线的拟合情况以确保正确性。对于压痕深度的确定，在数据分析软件中打开每个生成的力-距离曲线，选择赫兹（Hertz）拟合模型作为分析过程。应用减去基线偏移选项，使垂直偏转轴归零，并选择偏移加倾斜校正功能。

使用查找接触点功能自动识别接触点。利用垂直探针位置功能，从压痕过程中的原始压电陶瓷高度中减去仅由悬臂梁弯曲引起的距离。选择弹性拟合选项以显示处理后的力-距离曲线。

然后选择图形区域，使其与垂直探针位置轴上最负的值对齐。在参数选项卡中，从 XMIN 框内读取并记录压痕值。含有单根纤维的圆盘显示出较高的刚度值，中位数为 2.6 千帕，代表未受损的健康软骨区域。

随着骨关节炎的发生和发展，原子力显微镜（AFM）测量显示，双串结构的刚度显著逐步下降42%，小簇结构下降77%，而在以大簇结构为代表的晚期阶段，刚度最终下降88%。呈现弥散模式的软骨盘表现出弹性升高，并且单个杨氏模量值存在显著变异。对于所有具有指定主要细胞模式组织的软骨盘，与所用设定点相关的压痕深度被发现与刚度呈反比关系。

在生成的力-距离曲线中观察到的伪影通常表明原子力显微镜（AFM）悬臂梁与软骨表面之间的接触不理想，或样品在培养皿上的固定不当。我们的软骨外植体可进一步采用多种分子生物学技术进行处理和分析，例如通过ELISA进行蛋白质分析、免疫标记、Western印迹，或通过PCR进行基因分析。该方法可用于研究新疗法对关节软骨的直接影响，并可能帮助研究人员深入了解骨关节炎的潜在发病机制。