利用原子力显微镜、冲击压痕和流变仪表征脑组织的多尺度力学特性

这些力学表征技术的总体目标是在不同的长度尺度和加载速率下测量生物组织的黏弹性特性。这些方法可用于回答生物工程领域的关键问题。例如，大脑在极高加载速率下如何发生形变，或者多发性硬化症或自闭症等疾病如何影响脑组织的力学性质。

这些技术的主要优势在于，对于像生物组织这样刚度极低且高度水合的材料，可以在广泛的加载条件下进行测试，同时也可以在大范围的材料体积上进行测试，小至单个细胞，大至整个脑组织。这些技术的应用意义在于对脑损伤过程中的响应进行建模，这对于设计防护策略具有重要意义。尽管该方法可为脑组织的力学特性提供深入见解，还可应用于其他柔软的生物组织，如心脏和肝脏。

在对柔软组织进行力学表征时，建立测量探针与组织之间的适当接触至关重要。小心地将一个标称弹簧常数为 0.03 牛顿每米、末端带有直径为 20 微米的硼硅酸盐玻璃小球的原子力显微镜（AFM）探针装入探针夹持器中。将固定在培养皿中的脑切片放置于已预热至 37 摄氏度的原子力显微镜载物台加热器上。

然后加入约两毫升预热的培养基。接着，小心地在原子力显微镜（AFM）探针上滴加一滴培养基，以防止探针在浸入脑片周围培养基时因表面张力而损坏。随后，将AFM探头重新放置到载物台上，并开始缓慢下降探头，直至其完全浸入培养基中。

使用光学显微镜移动载物台，使感兴趣区域位于已校准的原子力显微镜（AFM）探针下方，然后降低AFM探针使其与组织表面接触。为了进行蠕变柔量实验，需在软件的函数编辑器中构建一个施加力函数。该函数包括一个0.1秒的斜坡上升至5纳牛顿的设定点，保持20秒，随后在1秒内斜坡下降至0纳牛顿。

该软件将记录原子力显微镜（AFM）探针在施加力作用过程中对组织压痕深度的数据。在完成蠕变柔量实验后，通过在软件中设置施加的压痕函数，进行力松弛实验。运行该函数时，软件将同步采集AFM探针压入组织过程中所受力的数据。

开始进行冲击压痕测试时，使用镊子将球形探针滑动安装到摆锤上。然后将熔融石英样品柱安装到样品台上，并将样品台旋入平移台。为了实现对水合脑组织的动态冲击实验，首先需执行液体池校准。

进入软件中的校准菜单，选择液体池（Liquid Cell），并根据软件提示与熔融石英样品接触。接着，选择压头类型为“法向”（Normal），并使用默认的压头载荷值0.05毫牛顿（millinewtons）。然后点击继续，以完成法向压头配置的校准。

现在将样品台向后移动至少五毫米，并安装杠杆臂。通过选择压头类型为液体池，在新配置下重复液体池校准。单击“继续”以获取液体池校准因子。

接下来，增大电容器极板间距。增大电容器极板间距可增加最大可测深度，这在测试高顺应性材料时是必要的。使用扳手，将控制电容器极板间距的三个螺母顺时针方向小幅旋转拧紧。

每次顺时针旋转一周后，在维护菜单中选择“Bridge Box Adjustment”并进行一次良好的摆锤测试。继续缓慢调节螺母，直至“Approx. Depth Calibration”显示值达到70,000纳米/伏特或更高。

然后将一个新的限位挡块置于摆锤底部，该挡块可通过电源开关控制通断。将位于摆锤后方的原始限位挡块缩回，以消除对摆锤运动的潜在阻碍，从而实现更高的冲击速度以及在柔性样品中更深的穿透深度。打开电磁铁的电源，并将其电压设置为10伏。

接下来，进入实验菜单并选择“冲击与调整脉冲位移”。按照软件提示校准摆锤的摆动距离。当冲击压痕装置完全准备就绪后，吸除培养基并干燥脑片。

然后使用一层薄薄的氰基丙烯酸酯粘合剂将切好的脑组织固定在铝制样品柱上。接着将液体池滑过样品柱上的第二个O形圈，并向液体池中加入5毫升不含二氧化碳的培养基，以完全浸没组织。将浴槽沿X轴负方向移动，直至杠杆臂上的探针尖端准确定位在浴槽上方。

接下来，沿正Z方向移动，直至探针完全浸入溶液中，并位于样品前方。使用样品台控制窗口，小心地使探针与样品表面接触，然后将样品台从样品表面后撤约30微米。在“实验”菜单下，点击“冲击”（Impact），并设置一次冲击实验。

选择一个特定的冲击载荷，该载荷将根据摆动距离校准结果直接关联到相应的冲击速度。然后运行预定的实验。当摆锤回摆且样品表面继续移动至测量平面时，关闭下限位开关。

软件将记录探针随时间的位移。将砂纸贴附在直径为25毫米的测量探针上。然后，安装热系统并固定探针。

最后，将另一片砂纸固定在底板上，并与顶板对齐。按照仪器制造商的说明校准流变仪。首先，将探针上的力归零。

其次，使探针与底板接触。然后测量探针的惯性。最后，进行电机调节。

然后缓慢降低测量板。当测量板距离组织表面约1毫米时，以0.1毫米的步长继续下降，直至测量板完全接触组织上表面，且测得的法向力达到预期值。在样品边缘滴加少量培养基，以维持实验过程中组织的湿润状态。

放下加热罩。接着，点击“文件”、“新建”，在“凝胶”选项卡下选择“频率扫描”。然后点击窗口测量中的“频率扫描”，并双击振荡设置框。

输入频率范围、应变和数据点数。最后，选择“确定”并点击“开始”以启动频率扫描。以下是蠕变柔量和应力松弛实验的典型压痕深度和力随时间变化的响应曲线。

利用这些数据和系统的几何结构，可以计算大脑不同区域的蠕变柔量和力松弛模量。冲击压痕法可测量组织在空间和时间上高度集中的高加载速率下的力学性能。通过在不同冲击速度下量化所得到的冲击响应参数，可为研究组织的速率依赖性特性提供一种手段。

流变学通过储能模量和损耗模量来测量整体组织的频率依赖性黏弹性特性。在低频条件下，储能模量比损耗模量大约一个数量级，表明脑组织的行为主要由弹性特性主导。在进行该操作时，必须保持组织充分水化，或将其浸入有助于维持其正常结构的液体中。

这些已展示技术的发展为材料研究人员设计并优化能够模拟大脑力学响应的合成凝胶铺平了道路。观看本视频后，您应充分理解如何利用原子力显微镜进行压痕、冲击压痕和流变学测试，以表征组织的黏弹性力学特性。在解读所采集数据时，请牢记其基本假设：即组织的变形体积在结构上是均匀的，且具有弹性各向同性。

这并不一定适用于所有生物组织。当您对生物组织力学特性的研究问题有了更明确的定义后，可以选择一种或多种这些力学实验，以在感兴趣的适当空间尺度或时间尺度上回答该问题。