小鼠模型中基于乙醇的消融溶液的导管内递送及X射线可视化用于乳腺癌的预防与局部治疗

乳腺癌是美国女性中最常见的癌症，也是女性因癌症死亡的第二大原因。目前的预防方法有限，且伴随多种不良副作用。因此，亟需新的初级预防干预措施。我们开发了一种将基于乙醇的消融溶液经导管递送至小鼠乳腺上皮的方法，用于乳腺癌的预防。

直接向乳头开口注射可靶向导管树内衬的上皮细胞，同时最大限度减少对周围组织的损伤。该方法可利用氧化钽纳米颗粒作为高分辨率对比剂，实现同步活体成像。该技术可调整用于其他X射线对比剂，以及不同化学或热消融溶液的多种预防性治疗。

该图像引导的乳腺癌预防方法的第一步是通过使用实验室制备的含蔗糖素凝胶杯口服给予卡洛芬，从而实施长期抗炎治疗。我们使用脱毛膏去除乳头周围区域的毛发，以准备动物。然后在体视显微镜的辅助下进行乳腺导管内注射，以便最佳地定位并观察乳头开口，便于针头插入。

注射溶液后，通过微型CT或荧光透视成像来评估注射效果。微型CT扫描数据可进行处理，以生成注射后乳腺导管树的三维重建图像，用于进一步分析导管填充情况及其他相关指标。首先，配制所需浓度的卡洛芬溶液。

我们配制浓度为每毫升含2 mg的溶液，每杯注射0.5 mL，以达到每杯1 mg的终剂量。可在混合物中加入无菌食用染料，以便更好地确认药物已充分混入杯中的蔗糖素。接下来，将杯子置于60摄氏度的水浴中15分钟。

取出杯子并擦干，以尽量减少污染的可能性。使用70%乙醇或乙醇擦拭巾清洁杯盖表面，并静置晾干。使用注射器通过杯盖注入所需剂量的卡洛芬溶液。

在此情况下，为达到理想效果，需要注入 500 µL。用贴纸盖住针孔，将杯子摇晃 15 秒，然后再涡旋振荡 15 秒。通过观察是否存在深蓝色团块来检查杯子中溶液是否混合均匀。

杯子可冷藏保存长达一个月。应在导管内操作前两到三天开始准备动物。首先使用异氟烷对动物进行麻醉。

将麻醉后的小鼠转移至持续输送异氟烷的鼻罩。在鼻罩处为小鼠涂抹眼用润滑剂，然后将小鼠仰卧位固定。使用棉签将脱毛膏涂抹于计划注射的乳腺区域。

在动物所需区域的皮肤上上下擦拭涂抹器，以帮助毛发更快松脱。为避免灼伤皮肤，应尽可能缩短脱毛膏在小鼠身上的停留时间。涂抹10至30秒后，使用浸有温水的纱布彻底清除脱毛膏。

使用两到四次清洗，确保完全清除后，再用干净的纱布擦干皮肤。检查脱毛区域，确认乳头视野清晰且易于接触。如有必要，重复脱毛操作。

将小鼠放入装有加热垫的清洁恢复笼中，使其从麻醉状态中恢复。小鼠恢复后，在其饲养笼中给予一片卡洛芬。接下来，再次使用异氟烷麻醉动物，待其完全麻醉后，将小鼠转移至鼻罩。

在将动物仰卧放置以进行注射前，需涂抹眼用润滑剂。可将靠近将要注射的乳腺部位的腿部用胶带固定，以方便操作，但此步骤并非必需。准备注射器时，应抽取所需注射液体的体积外加一微升，以防拔出针头时液体溢出造成剂量不足。

在注射前，可注入额外体积的溶液以检测针头是否通畅，确保溶液能够顺利流出。如果需要注射多个乳腺，可预先准备多个注射器以节省时间（如有条件）。若溶液静置后容易发生堵塞，则应注意不要过早完成预填充。

如有必要，可使用尖头镊子清除乳头表面可见的死皮。如果死皮未堵塞乳头开口且不易牵拉脱落，则无需完全清除。若死皮与活体皮肤紧密粘连，强行去除有时可能导致乳头损伤和肿胀。

在可见针头斜面的情况下，借助尖头镊子的引导，将针头插入乳头开口处。根据乳头的长度和坚挺程度，在引导针头进入时可能无法始终夹持乳头。有时需要通过针头调整乳头的位置，使镊子能够将乳头向上拉过针头，而不是将针头向下引入乳头内。

当针尖斜面完全被乳头包围并进入主乳管后，开始缓慢注入溶液。理想速率为每分钟约 40 µL。避免注射速度过快，以防对导管树造成可能的损伤。

注射完成后，使用镊子辅助，等待30秒后再将针头从乳头中取出，以尽量减少乳头处的液体渗漏。检查注射区域，观察是否存在注射失败的任何迹象。

隆起的外观可能提示脂肪垫注射或该区域受到创伤。如果注射液含有染料，或您正在仔细观察注射部位是否出现隆起（如此处所示），通常可以观察到正在向脂肪垫内注射。以类似方式继续注射实验所需的其余乳腺，记录注射体积及任何渗漏情况。

由于手部摆放不便或呼吸干扰等问题，小鼠的某些区域可能较难进行注射。例如，惯用右手的操作者在注射小鼠右上方的腺体时可能会遇到最大困难，如图所示。这些腺体因靠近肺部而活动较多，且动物身体会阻碍手腕在台面上稳定支撑，导致难以找到合适的手部操作位置。

如果鼻锥允许，有些人可能会发现重新调整小鼠位置更为方便。注射含乙醇溶液时，必须注意避免全身性酒精中毒。这需要了解单次实验中可注射的乙醇最大量，并在操作过程中通过腹腔注射含蔗糖溶液以抵消其影响。

导管内操作后，可将动物置于清洁笼具中的加热垫上恢复，或直接转移至微型CT系统进行导管树填充成像。任何成像操作后均应使小鼠恢复。将注射后的动物转移至微型CT系统后，需继续给予异氟烷以维持成像期间的麻醉状态。

通过将待成像部位附近的腿部用胶带固定，有助于标准化成像位置。例如，将后肢以伸展姿势固定，可避免腿部骨骼遮挡注射腺体的视野；同样，将前肢向上伸展并固定，也有助于观察上部腺体。

我们还发现，在小鼠腹部进行跨腹贴扎有助于减少下部腺体的呼吸伪影。可视化导管树存在多种可接受的扫描参数。应始终注意确保这些扫描所产生的辐射剂量不超过特定品系小鼠的辐射限值。

通过观察透视成像并记录递送是否成功，而非采用更长曝光时间获取图像，可显著降低辐射剂量。如果仅需获取较短的两分钟标准扫描图像，我们标准的扫描参数适用于重复成像。在实施安乐死前作为终末性操作，可接受最高分辨率、最长达14分钟的扫描。

这些较长的扫描时间在纵向研究中不可接受，因为可能导致动物出现辐射病。该动物的第四和第九对腺体被注射了含有100毫摩尔氧化钽造影剂的乙醇溶液。当前的采集是对已注射的下部腺体进行的14分钟高分辨率扫描。

动物的透视成像使我们能够观察到造影剂在注射液中突出显示的导管树结构。我们使用的微型CT系统内置软件，可快速生成图像以评估注射效果，而无需进行正式分析。该功能配有简单的对比度滑块，可实现合理的信噪比降低。

这些图像的局限性在于对整幅图像应用了相同的信号阈值，这会导致明显不属于导管树的强信号（如饮食中的铁）保留在图像中。通过使用更复杂的分析软件对感兴趣区域进行分割，可以获得更理想的图像。

为了获得最佳的单一导管树成像效果，我们建议将乳腺脂肪垫分割出来以进行进一步的图像处理。该过程需要在整个动物切片的完整厚度范围内逐层勾画脂肪垫的边界。我们发现，每隔三个切片进行一次轮廓勾画，并将对象进行传播，即可充分完整地捕捉到导管的全部结构。

这一过程可能具有主观性，需要遵循实验室的描迹标准，以确保所有分析扫描图像的人员获得相似的结果。熟悉解剖结构有助于判断应包含哪些区域。在完成描迹传递后，可对重建图像进行阈值设定，限定在特定范围内，仅显示乳腺组织内的对比信息。

这应该是导管树内的溶液以及其紧邻区域的任何泄漏情况。对于含五氧化二钽的溶液，通常300至3,000 HU的范围效果较好。此处可从多个角度查看一个完全处理后的示例。

根据动物在微型CT中的摆放方向，可能需要在分析软件中重新调整DICOM文件的方向，以使解剖结构呈现直观的定位，即动物头部位于图像上方。如果每次未以相似方式旋转图像，则可能难以判断所观察的是哪一侧腺体。在完成导管树的重建后，可进一步进行体积或长度等测量。

通过本方法成功递送的验证不仅可以通过此处所述的三维显微CT重建图像来证明，还可以通过双重染色的整体组织标本进行验证，其中注射的伊文思蓝与胭脂红明矾染色的完整导管树相互重叠。三维共聚焦显微镜可清晰显示经E-钙黏蛋白染色的透明化腺体中导管树的结构。不同品系之间以及小鼠个体之间的差异，以及乳头解剖结构的差异，可能导致腺体注射难度有所不同。

这是一个理想的乳头示例，其高度较高，便于抓握和注射。相比之下，较低平的乳头（如此处所示）可能更难以成功插管。这些差异可能导致注射成功且无创伤或隆起（如图所示），也可能导致注射失败，表现为脂肪垫注射部位出现隆起的外观。

在乳腺癌预防方面，目前主要采用两种策略。第一种是密切观察，不进行实质性的干预措施。采取这一策略的个体将定期接受监测，以检查乳腺组织中是否出现可能提示癌症形成的肿块。

疾病检测将促使治疗的实施。预防性乳房切除术是一种更为侵入性的手术，可清除乳腺癌可能发生的全部上皮细胞以及周围的间质组织。该手术可能带来严重的不良副作用，因此极少被选择作为低或中等疾病风险个体的预防性措施。

我们的方法是通过将消融溶液直接注射到乳腺导管树中，实现局部上皮消融。该方法可减少附带损伤，对于疾病风险不严重的个体而言，可能更具吸引力。注射后立即进行成像时加入对比剂，也使得该技术易于向临床转化。