丝状蓝细菌延时显微镜分析的垂直固定方法

在细菌中，研究细胞分裂蛋白的动态变化需要对细胞进行空间定向。例如，对于细菌细胞分裂的主要组分——Z环，垂直定向对于在XY平面上完整记录其结构至关重要。在本视频中，我们建立了一种方法，以实现丝状蓝细菌鱼腥藻（Anabaena）的这种特定取向。

Anabaena 是一种多细胞光合生物，与其他细菌一样，能够利用大气中的二氮作为氮源。在缺乏化合态氮的情况下，Anabaena 会分化出专门用于固氮的细胞。因此，它是研究细胞分化与多细胞性之间关系的优良模型。

首先，选择在目标丝状蓝细菌菌株中存在的分裂体组分。实验需要构建一种表达所选分裂体组分与荧光蛋白融合的丝状蓝细菌突变株。在本方案中，我们以表达FtsZ与GFP融合蛋白的鱼腥藻（Anabaena）突变株为例。

首先，取10毫升处于稳定期的突变株培养物，接种于90毫升液体培养基中，制备新鲜的继代培养物。然后在恒定光照和最适温度下培养新细胞，直至进入对数生长期。在本示例中，突变株在25°C条件下培养了七天。

取两毫升的生长培养物，放入离心管中。在室温下以 2,500 × g 离心 10 分钟。离心结束后，检查所有细胞是否均已沉淀至管底。

处理样品时需小心，避免重新悬浮。将3%低熔点琼脂糖溶液放入微波炉中加热。加热时应采用短时间间隔进行，并随时检查溶液，直至完全液化。

待其融化后，放置一旁冷却。取出上一步的离心管，弃去1.9毫升上清液，用移液器上下吹打至少三次，将细胞重悬于剩余液体中。在工作区域放置装有细胞的离心管、融化的琼脂糖溶液、尖端被剪断的一毫升注射器，以及带有新且洁净刀片的手术刀。

然后用移液器至少吹打三次，将细胞与900微升的3%琼脂糖溶液混合。确保琼脂糖溶液温度不过高但仍保持液态，这一点非常重要。这样可以避免在此过程中对细胞造成损伤。

下一步操作必须迅速进行，并在琼脂糖溶液凝固之前完成。用一个一毫升的注射器小心地吸取琼脂糖基质。在吸取样品时，应避免产生气泡。

随后，将注射器置于水平位置，在室温下孵育样品两小时。孵育结束后，在洁净平整的表面上，小心使用推杆将含有细胞的基质完整取出。使用解剖刀将凝胶样品切成尽可能薄的片状，同时保持基质的完整性。

然后将样品并排置于相应的盖玻片上。如视频所示，在此步骤中，可使用移液枪头辅助样品的操作过程。对于延时实验，建议使用专为显微镜分析设计的细胞培养小室。

在此情况下，我们使用可放入此类腔室的圆形盖玻片，如视频中所示。最后，为防止样品脱水，需在腔室内加入额外体积的熔融3%琼脂糖溶液。成像前，请等待琼脂糖完全凝固。

现在将含有细胞的培养室置于显微镜下进行成像。建议使用具有温度和湿度控制功能的设备。使用最大放大倍数在明场下观察样本，并寻找垂直方向的丝状结构。

可以利用Z平面的自发荧光信号进行初步扫描，以找到感兴趣的分裂位点。随后，使用荧光蛋白标记物的参数来观察目标蛋白在分裂位点处的信号。接下来，可根据具体的生物学模型和目标蛋白开展时间序列成像实验。

在这种情况下，我们可以在 XY 平面上观察到 FtsZ-GFP 突变体中 Z 环的完整结构。通过我们的方法，能够长时间记录这些环的动态变化。最后，根据荧光强度的变化，我们得出结论：在我们的模型中，该结构具有高度动态性。

该方法是一种快速且低成本的方案，通过共聚焦显微镜对丝状蓝细菌（以鱼腥藻为模型）等复杂形态的分裂位点进行蛋白质动态监测。