基于样品腔的光片荧光显微镜中对多个昆虫胚胎进行同步活体成像

基于样品腔的光片荧光显微镜旨在实现高通量成像而非高内容分析。因此，活体成像实验必须依次进行，从而较少受到环境变异的影响。我们的蛛网式支架可实现多个胚胎的堆叠和同步成像，消除了环境变异并提高了通量。

将胚胎装入蛛网状固定架需要一定的技巧。通过一段说明性视频来展示一系列简短操作动作的顺序最为理想。用于光片荧光显微镜样品腔的校准。

首先，在80摄氏度的干式恒温混匀仪中重新熔化一份琼脂糖样品。待熔化的琼脂糖冷却至35摄氏度后，取50微升琼脂糖转移至1.5毫升离心管中。将0.5微升荧光微球溶液与琼脂糖在1,400转/分钟条件下混匀1分钟，然后取10微升琼脂糖-荧光微球混合溶液填充至蛛网状支架的槽孔中。

尽可能吸去琼脂糖，直至仅剩一层薄薄的琼脂糖膜，静置30至60秒使其凝固。用经高压灭菌的自来水注满样品室，缓慢将蛛网状支架插入样品室中。将槽孔移至检测镜头前方，并将支架旋转至相对于照明轴和检测轴呈45度的位置。

蛛网支架在透射光通道中不应可见。切换至适当的荧光通道，并调整激光功率和曝光时间，使荧光微球提供适当的信号。设定一个视场体积，完全覆盖当前呈横向取向的琼脂糖薄膜，并计算针对相应照明和检测物镜组合所能达到的最大轴向分辨率，以确定Z轴步进间距。

然后，记录荧光微球的三维测试Z轴层叠图像，并将X、Y和Z方向的最大投影与校准图进行比较。如果微球图像模糊、弥散或失真，则调整照明和/或检测物镜的位置。

进行胚胎去壳时，每组在六孔板的 A1、A2、A3 和 B3 孔中各加入 8 毫升经高压灭菌的自来水。然后，在 B1 和 B2 孔中各加入 7 毫升经高压灭菌的自来水和 1 毫升次氯酸钠溶液。将六孔板置于体视显微镜下，将第一个含有胚胎的细胞筛放入 A1 孔中。

将筛子移至B1孔前，在轻微振荡下清洗胚胎30至60秒。剧烈振荡培养板30秒后，再将筛子转移至A2孔。在轻微振荡下清洗胚胎1分钟，然后将筛子移入B2孔进行剧烈振荡，直至大多数胚胎完全去壳。

然后，将滤网转移至 A3 孔中轻柔清洗一分钟，随后将去壳胚胎的滤网保存在 B3 孔中，直至其他品系的胚胎完成如上处理。为将胚胎装载到蛛网状支架上，按前述方法重新溶化另一份琼脂糖。待琼脂糖冷却后，将蛛网状支架置于体视显微镜下，并向槽孔中加入 10 µL 琼脂糖。

用移液枪吸头将琼脂糖涂抹至带槽孔上，然后尽可能吸出多余的琼脂糖，仅留下一层薄薄的琼脂糖膜。待琼脂糖凝固后，使用画笔小心挑取胚胎并将其转移至琼脂糖膜上。将胚胎沿槽孔的长轴方向排列，使其头尾轴与槽孔的长轴方向一致。

为了稳定胚胎，小心地将一到两微升琼脂糖注入胚胎与琼脂糖膜之间的缝隙中。待琼脂糖凝固后，缓慢将载有胚胎的蛛网状支架插入已加入成像缓冲液的样品室中。进行胚胎成像时，需确认蛛网状支架相对于照明和检测轴呈45度角，并在透射光通道中将胚胎移至视野中央。

蛛网支架不应可见。接下来，使用微调移动平台在Z轴方向上移动胚胎，直至胚胎的中平面与焦平面重合，且轮廓清晰。在不切换至荧光通道的情况下，将胚胎在两个方向上各移动250微米，以确定视野范围。

如果需要沿多个方向进行成像，请适当旋转胚胎，将胚胎调至焦点，并如前所述确定视场体积。随后，对所有其他已固定的胚胎重复此操作。当所有胚胎的视场体积均确定后，设定荧光通道和时间推移参数，并启动成像过程。

对于持续数天的实验，应考虑至少部分覆盖样品室开口，以减少蒸发。成像实验结束后，小心地将蛛网支架从样品室中取出，并使用小号画笔将胚胎从琼脂糖膜上轻轻分离，然后将其转移至适当标记的显微镜载玻片上。将载玻片放入回收皿中，在适当的常规培养条件下进行孵育。

随着孵化时间的临近，需频繁检查回收培养皿，将已孵化的幼虫转移至24孔板的各个独立孔中。向孔中加入适量生长培养基至半满，然后在适当的标准培养条件下孵育幼虫。当观察到的个体发育至成虫阶段时，提供合适的交配对象，并在数天后检查子代情况。

在本视频中，可以观察到源自三种不同转基因果蝇品系的胚胎在约一天时间内的荧光信号动态变化。由于这些品系均在假定普遍表达且持续活跃的启动子调控下表达核定位的EGFP，因此预期会呈现相似的荧光模式。然而，比较性的活体成像结果揭示了表达模式存在显著的时空差异，这些差异并非由环境变异引起的继发效应。

在对三例携带相同基于piggyback转座子的转基因赤拟谷盗胚胎的分析中，比较其原肠胚形成期间绒毛膜窗口闭合过程的活体成像结果表明，第二个亚系的整体信号强度显著强于另外两个亚系。这些数据表明，基因组环境可能对赤拟谷盗中外源基因的表达水平具有显著影响。

我们的方法非常适合分析基因敲低和基因敲除表型，因为它能够同时对野生型对照胚胎进行成像。本方案还可用于比较两种或多种昆虫物种的形态发生过程，从而更深入地理解发育的进化机制。