辅酶Q过量条件下线粒体通透性转换孔开放概率的评估

本方案提供了一种研究线粒体通透性转换孔低电导开放状态的新方法。该技术的主要优势在于能够简便地测量孔道开放概率随线粒体膜电位变化的关系。该技术可广泛应用于从任何器官系统及物种中分离的线粒体。

首先校准氧电极，将一滴50%氯化钾电解液溶液置于电极片的圆顶上。在电解液液滴上放置一小块面积为2平方厘米的香烟纸垫片，并覆盖一块稍大的聚四氟乙烯膜。然后使用涂抹工具将小电极片O形圈推入电极的圆顶上。

接下来，用电解液补充储液井。将较大的O形圈放入电极片井周围的凹槽内。然后将电极片安装到电极室中，并将其连接至控制单元。

向反应室中加入 2 毫升空气饱和的去离子水和聚四氟乙烯涂层磁子。完成后，将反应室连接至控制单元后端。将温度设置为 37 °C，搅拌速度设置为 100。

校准前，让系统温度平衡10分钟。确保温度、搅拌速度和压力正确后，在“校准”选项卡下选择“液相校准”选项以执行液相校准。然后按“确定”，并等待信号达到稳定平台期。

达到平台期后，按下“确定”。然后向反应室中加入约20毫克连二亚硫酸钠，以建立无氧环境。再次按下“确定”，等待信号达到稳定平台期后，点击“保存”按钮以确认校准。准备四苯基磷（TPP）选择性电极组件时，使用注射器和柔性针头将10毫摩尔的TPP溶液注入TPP选择性电极尖端。

填充电极尖端时避免产生气泡。松开电极 holder 帽，将内参比电极插入 TPP 尖端。完成后，组装 TPP 选择性电极装置，包括参比电极和电极 holder。

拧紧帽盖以固定探头。然后将电缆连接至控制箱的辅助端口和TPP电极架。将TPP选择性电极和参比电极插入离子选择性电极专用的推杆组件中。

将参比电极连接到控制盒的参比端口。接下来，准备反应室：向反应室中加入一毫升反应混合物，避免产生气泡。使用带有TPP选择性电极和参比电极的适配推杆组件密闭反应室。

关闭反应室后，使用带有塑料管路的独立微量注射器将额外试剂直接注入反应室。当装置准备就绪后，点击“开始”以启动记录。获得稳定的电压信号后，通过逐次加入0.1毫摩尔TPP溶液（每次增加1微摩尔），使终浓度达到3微摩尔，从而对TPP选择性电极进行校准。

观察每次添加后TPP电压信号的对数下降。在氧浓度和TPP信号稳定后，通过推杆组件上的试剂添加口向反应室中加入100微克新鲜制备的心肌细胞线粒体，终浓度为0.1毫克/毫升。观察线粒体被激活并消耗氧气时，反应室中氧水平的下降。

此外，观察线粒体产生膜电位并从溶液中摄取TPP时，TPP电压信号的急剧上升。然后加入2.5微克/毫升的寡霉素以诱导状态4呼吸。为评估线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放概率，观察在渗漏呼吸期间膜电位随时间的下降情况。

当达到目标膜电位后，向反应室中加入一微摩尔的环孢素A（cyclosporine A）作为mPTP抑制剂，以评估在该特定膜电位下mPTP的开放概率。随后，测量加入环孢素A前后其对氧气消耗和膜电位的影响。在同步记录的氧气消耗与膜电位的代表性曲线中，高膜电位相对于两微摩尔TPP校准水平设为零，中等电位设为五毫伏，低电位设为十毫伏。

在零毫伏时，线粒体的mPTP关闭概率为100%，而在10毫伏时则表现出100%的开放概率。加入寡霉素后，未观察到耗氧量发生显著变化，表明三磷酸腺苷（ATP）合酶对状态2呼吸的贡献极小。此外，比较了加入环孢素A前后耗氧速率和膜电位的变化。

氧消耗速率降低以及膜电位趋于稳定，表明开放的线粒体通透性转换孔（mPTP）发生关闭。当mPTP处于关闭状态时，氧消耗速率未见下降，且膜电位持续降低。实验结果表明，在FVB对照组和Fmr1基因敲除型心肌线粒体中，高膜电位和低膜电位下mPTP处于关闭和开放状态的概率相似。

在中间膜电位下，Fmr1 基因敲除型心肌线粒体的mPTP关闭概率较FVB对照组升高。向检测室中加入液体时不得引入气泡，否则会导致氧气消耗读数不稳定，增加结果解读难度。完成此步骤后，可测定钙负荷能力。

该方法可评估孔道的高电导开放状态，并补充了我们技术的结果。