线粒体呼吸功能的可视化：细胞色素C氧化酶/琥珀酸脱氢酶（COX/SDH）双重染色组织化学方法

本实验的总体目标是实现对新鲜冷冻组织切片中线粒体呼吸酶缺陷的直接可视化。首先从目标器官获取冷冻切片，完成第一步。实验的第二步是进行细胞色素氧化酶（Cox）组织化学染色，随后进行琥珀酸脱氢酶（SDH）组织化学染色。

最后，将组织切片脱水、封片并加盖盖玻片。最终结果可通过细胞蓝色染色的程度来显示线粒体功能障碍的水平。大家好，今天我们将介绍细胞色素C氧化酶与琥珀酸脱氢酶（Cox/SCH）双重标记组织化学技术。

尽管该方法可用于研究线粒体疾病，但也可为衰老及与年龄相关疾病提供深入见解。在依照伦理许可处死动物后，迅速取出其脑组织，并用干冰快速冷冻。冷冻组织可用铝箔包裹后于零下80摄氏度保存，直至准备切片。

将脑组织置于冷冻切片机样品头，并用包埋剂包裹，以制备冷冻切片。迅速将样品头放入冷冻切片机中，在 -21 °C 下切取 14 微米厚的切片。使用加热板将切片展平贴附于载玻片上，随后在室温下干燥 1 小时。

将切片放入含有湿润滤纸条的切片染色盒中。由于本实验中反应时间至关重要，建议每次实验在通风橱内最多处理10张切片。用PBS配制含有DAB和细胞色素C的孵育液，并涡旋混匀。

迅速将两微克牛源CDE加入培养基中，并通过涡旋充分混匀。在通风橱内操作，将150至200微升孵育培养基用移液器枪头加至每张载玻片上，均匀铺展至所有区域，以彻底分散尚未完全溶解的CDE颗粒。将载玻片于37摄氏度孵育40分钟。

孵育40分钟后，从载玻片上移除孵育液。用PBS洗涤载玻片4次，每次10分钟。洗涤完成后，将载玻片放回带有湿润滤纸条的染色缸中，并在通风橱内操作。

在 PBS 中配制 NBT 溶液，注意避光保护 PMS，快速涡旋混匀溶液，用移液器吸取 150 至 200 微升 NBT 溶液加至每张切片上，并用枪头将溶液均匀铺布于所有组织区域。将切片在 37 摄氏度孵育 40 分钟，孵育结束后去除切片上多余液体。用 PBS 洗涤切片 4 次，每次 10 分钟。

将切片依次在以下浓度的乙醇中各脱水两分钟：70%、70%、95%、95% 和 99.5%。最后，在另一份 99.5% 乙醇中放置 10 分钟。将切片放入二甲苯中 10 分钟，然后用 LAN 封片并加盖盖玻片。

将载玻片置于通风处过夜，或至少干燥一至两小时。对野生型和早衰型线粒体DNA突变小鼠的脑组织切片依次进行细胞色素C氧化酶（COX）和琥珀酸脱氢酶（SDH）活性染色。

野生型小鼠海马中可见正常的细胞色素c氧化酶（Cox）活性，表现为深棕色染色。在12周和46周龄的线粒体DNA突变小鼠海马中，Cox活性缺乏表现为蓝色染色。在46周龄的M-T-D-N-A突变小鼠中，Cox活性进一步降低，提示呼吸链功能障碍广泛加重。

10 分钟和 25 分钟的孵育时间不足，导致棕色 DAB 反应产物的沉积减少。缩短的孵育时间使得在 SDH 孵育过程中形成蓝色的 Foran 终产物，从而错误地提示存在 COX 缺陷的细胞。在 COX 孵育过程中盖玻片的操作也导致 DAB 反应产物的形成和沉积不准确。

尽管此处所示可分别标记细胞色素c氧化酶（Cox）和琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性，但顺序标记法已被证明在定位线粒体功能障碍细胞方面具有优势。野生型小鼠脑组织中COX和SDH活性特异性对照的一个示例显示为阴性标记。因此，请务必注意，在进行Cox-SCH双重标记实验时所涉及的化学试剂具有极高危险性，每次实验都必须采取防护措施，例如穿戴适当的实验服和口罩、在通风橱内操作，并妥善处理孵育液。