从小鼠多种组织中分离中间丝蛋白以研究衰老相关翻译后修饰

本生化实验的总体目标是从多种小鼠组织中分离富含中间丝的组分，以研究不同组织特异性中间丝蛋白的翻译后修饰。该方法有助于回答中间丝研究领域中的关键问题，例如这些重要的应激保护性细胞骨架蛋白在哺乳动物衰老过程中其功能与调控如何受到影响。该技术的主要优势在于，引入自动化组织裂解步骤可使用户快速高效地处理多个组织样本。

首先，将1毫升预冷的含蛋白酶抑制剂的Triton X-100缓冲液加入玻璃匀浆器中，并置于冰上。从液氮储存中取出一小块组织，直接放入玻璃匀浆器内。在整个操作过程中，始终保持匀浆器和样品处于冰上，使用聚四氟乙烯研杵进行约50次上下研磨，充分匀浆样品，同时尽量减少气泡的产生。

将裂解液转移至预冷的1.5毫升微量离心管中，置于冰上，在4°C条件下以20,000 × g离心10分钟。随后，收集Triton X可溶性上清组分至另一新管中。该组分可用于免疫沉淀以及IF蛋白的去垢剂可溶性组分的分析。

然后，向组织沉淀中加入1毫升含有蛋白酶抑制剂的高盐缓冲液。转移至洁净的匀浆器中，匀浆100次。将匀浆液转移回微量离心管中，并将管子置于冷室内的旋转摇床上孵育1小时。

在4 °C条件下，以20,000 × g离心匀浆液20分钟，弃去上清液。向沉淀中加入1 mL冰冻的PBS EDTA缓冲液，并将其转移至洁净的匀浆器中，作为最终的纯化步骤。匀浆后，将样品转移至新管中，在4 °C条件下以20,000 × g离心10分钟，获得富含IF蛋白的高盐提取物（HSC）。

弃去上清液，将沉淀重悬于300微升预热的非还原性SDS样品缓冲液中。先通过移液吹打和涡旋振荡分散沉淀，然后在95摄氏度加热样品5分钟。

根据需要进行涡旋和移液，以确保沉淀物完全溶解，这可能需要数分钟。将所有样品在负20摄氏度下保存，直至进行分析。为进行RNA提取，将裂解缓冲液加入含有赖氨酸基质D的离心管中，然后将待测组织加入组织破碎仪中，脉冲处理两次，每次25秒。

通过20,000 × g离心将裂解液与基质分离。若制备总裂解液用于蛋白质提取，向含有赖氨酸基质SS的赖氨酸管中加入Triton X-100或SDS上样缓冲液，然后加入待测组织样本。短暂脉冲振荡以混匀样本。

为制备 HSC，使用磁铁从离心管中移除不锈钢珠，然后在 4 摄氏度下以 20,000 × g 离心 10 分钟。分离上清液和沉淀组分，并按照视频中先前演示的步骤进行操作。通过将 10 微升 T20 加入 50 毫升 pH 7.4 的 PBS 中来配制 PBST 缓冲液。

然后，通过将1至10微克抗体加入200微升PBST中，制备PTM抗体溶液。取50微升磁珠分装至微量离心管中。将管子置于磁力架上，吸除磁珠储存液。

通过将磁珠重悬于免疫沉淀抗体溶液中，并在室温下于旋转仪上孵育20分钟，使磁珠与免疫沉淀抗体结合。将离心管置于磁力架上，吸除抗体溶液。随后用200微升PBST洗涤一次抗体偶联的磁珠，并移除洗涤液。

向珠子中加入0.6至1毫升组织裂解液，轻轻吹打混匀，于4°C旋转仪上孵育3小时。将离心管置于磁力架上，吸除裂解液，随后用200微升PBST洗涤珠子5次。

最后一次洗涤步骤后，收集磁珠和100微升PBS，将磁珠转移至一个新的洁净离心管中。将离心管置于磁力架上，吸除PBS。从磁力架上取下离心管，加入100微升非还原性上样缓冲液。

从离心管中取出50微升分装样品，加入5% 2ME以制备还原性样品。将样品在95摄氏度加热5分钟。将离心管置于磁铁上，收集珠子中的免疫沉淀组分，并转移至新的离心管中。

将样品在负20摄氏度下保存至分析前。为避免蛋白质样品在质谱分析中受到污染，操作所有凝胶时应佩戴洁净手套，并将其置于仅用去离子水清洗过的洁净容器中孵育。按照标准条件，在SDS-PAGE凝胶上上样20至50微升HSE样品进行电泳。

根据文本方案染色后，将凝胶置于塑料膜保护袋之间。然后扫描凝胶，并标记出需要切取的条带。使用一把新的、洁净的剃刀切下IF蛋白条带，并将切下的条带放入预先置于冰上的洁净微量离心管中，随后送样进行质谱分析。

该图显示了使用快速方法分离的九种小鼠组织中HSE的典型结果。需要注意的是，该方法在胰腺和脾脏中的效果不佳，并且在大肠样本中会产生额外的条带。该基因表达分析表明，角蛋白8（Keratin 8）在衰老过程中表达上调。

此外，Western印迹结果显示，角蛋白8在老年小鼠肝脏中显著上调。此处采用自动化方案获得的肝脏HSE显示，凝胶中角蛋白8和18得到明显富集。质谱分析表明，来自老年小鼠肝脏的K8和K18具有多个磷酸化和乙酰化位点，而这些位点在年轻小鼠肝脏中并不存在。

与肝脏中角蛋白的变化类似，通过定量PCR分析脑组织发现，24月龄小鼠脑内GFAP mRNA的表达量相比3月龄小鼠升高了五倍。最后，对高盐提取物进行考马斯亮蓝染色的蛋白质分析，以及对总蛋白和乙酰化赖氨酸富集组分的免疫印迹分析表明，GFAP蛋白在老龄小鼠脑组织中表达上调且发生乙酰化修饰。在完成该实验流程后，可进一步采用基于质谱的蛋白质组学等方法，探究中间丝蛋白在不同生理和病理生理条件下重要的翻译后修饰类型及其相互作用蛋白等科学问题。

观看本视频后，您应能充分理解如何从不同哺乳动物组织中分离中间丝蛋白。