利用原子力显微镜结合偏振显微镜测量肝脏硬度

我们的实验方案能够区分肝组织切片中富含胶原和缺乏胶原的区域，因此可用于更详细地研究纤维化形成过程。该技术的主要优势在于利用偏振光显微镜定位肝组织切片中富含胶原的区域。

我们的实验方案可为肝纤维化的研究提供重要见解，经过一定优化后也可适用于其他软组织（如肺组织）。首先，从零下80摄氏度取出冷冻的肝组织切片，在室温下解冻两分钟。用预冷的含4%多聚甲醛的PBS溶液在4摄氏度条件下固定切片10分钟，随后用PBS洗涤五次。

最后一次洗涤后，用纸巾擦去肝组织切片周围的多余 PBS，并用疏水性标记笔在肝组织切片周围标记出约 2 厘米 × 4 厘米的边界区域。用 PBS 覆盖样品，然后将样品装载到原子力显微镜（AFM）载物台上，并盖上 AFM 探头。在原子力显微镜（AFM）软件中，进入设置选项卡，并勾选自动保存选项，以自动保存所有文件。

然后，转至设置选项卡并点击保存设置，指定用于保存测量文件的文件名和目录。通过打开激光并点击接近键，使原子力显微镜（AFM）悬臂探针接近组织表面。接近完成后，点击一次回撤键，使悬臂探针回撤至压电陶瓷扫描器行程的顶端位置。

如有需要，使用原子力显微镜探头上的旋钮重新调整检测器位置。关闭激光。此时针尖已位于物镜的焦平面内。

接下来，通过点击附件选项卡并选择直接叠加光学校准，将显微镜的光学视野与原子力显微镜（AFM）测量图谱进行叠加。在随后出现的窗口中，点击“下一步”以获取探针在特定区域扫描的一系列图像。再次点击“下一步”进入下一个窗口。

在第一幅图像中，手动单击悬臂末端的中心，以在软件中标示针尖位置。可通过输入半径值调整标示针尖位置的圆圈大小，以提高准确性。单击“校准”按钮，可自动检测所有图像中的悬臂针尖位置。

通过查看图像确认探针检测的准确性。单击“下一步”，然后单击“完成”以结束光学叠加。接下来，使用偏振图像，在数据查看器选项卡中将载物台移动至绿色框内的富含胶原区域。

在“网格”选项卡下定义区域，然后在“数据查看器”选项卡中，于指定的绿色框内长按鼠标左键绘制矩形，以选择富含胶原的区域。单击“确认新扫描区域”，将所选区域设置为测量区域。设置反馈回路的参数。

将I增益设为50赫兹，P增益设为0.001。然后将设定点设为1纳牛。根据所研究材料的力学性能和悬臂的刚度选择相对设定点值。

设定合适的基线以正确拟合力曲线。然后根据样品表面形貌选择Z轴方向上悬臂的移动长度。将Z轴移动设置为恒定持续时间。

将延伸时间设置为1秒，延伸和回缩延迟均设为0。采样率设置为5,000赫兹。在Z闭环前打勾，以在测量过程中自动调节样品与悬臂针尖之间的距离。

然后取消选中“engage”按钮，以解除电动载物台的控制。打开激光器，使悬臂接近样品。点击“开始扫描”以采集力-距离曲线。

使用开源软件 AtomicJ 分析采集的数据。通过点击“处理力曲线和力图”图标，将力曲线加载到程序中。然后在处理助手界面中，通过点击“添加”按钮，将待分析的力图添加进去。

加载地图后，点击下一步。在下一个窗口中指定处理设置。若要使用一组拟合曲线参数自动估算样品与悬臂之间的接触点，请使用接触点的自动估算功能。

通过经典的聚焦网格法确定悬臂与样品之间的接触点。选择估计方法为模型无关法，以基于所测力曲线的质量获得最佳接触点判定，该方法需在数据处理优化过程中通过经验确定。使用经典模型（如用于模型拟合的经典L2模型）对力-压痕曲线进行拟合。

设置模型对回撤曲线的拟合。对于肝脏等软组织，建议将泊松比设为0.45。使用基线阶数为3、接触阶数为1来设置曲线拟合。

根据曲线与模型偏差的程度调整多项式拟合的阶数。选择Sneddon模型作为拟合力-距离曲线的模型。将球形探针的半径填写为2.9微米。

通过启用读取功能，从数据文件中加载弹簧常数和invOLS，然后点击完成。数据分析后，逐一检查力曲线，排除悬臂梁接近肝脏切片表面时出现错误的力曲线。

这些曲线具有较高的噪声和异常的形状。此后，数据可被复制或导出。在本研究中，采用原子力显微镜（AFM）检测了对照小鼠以及通过注射四氯化碳诱导产生轻度和重度纤维化的小鼠所获得的轻度固定的肝组织切片。

在对照组小鼠肝脏中，分析了靠近中央静脉的区域，这些区域通常对应于四氯化碳处理小鼠中胶原纤维形成的部位。在对照组肝脏的不同区域以及单个肝脏切片内的富含胶原区域，杨氏模量的分布具有一致的可重复性。在四氯化碳处理的小鼠中，对应于胶原沉积周围中央区域的刚度图显示，其杨氏模量值显著高于对照组小鼠相应区域。

此外，随着处理时间的延长，杨氏模量的数值显著增加。还评估了肝组织切片长期储存对其胶原纤维力学性能的影响。原子力显微镜（AFM）测量结果显示，储存三个月的切片在胶原富集区域的杨氏模量值显著低于两周内测量的切片。

肝脏切片的固定时间在很大程度上决定了肝脏切片的力学特性。我们建议必须严格遵守本方案中规定的时间间隔。在对方案进行一定优化后，该方法也可用于其他表现出显著胶原沉积的软组织，此类沉积可通过偏振显微镜检测到。

该技术为研究人员提供了一种统一且便捷的方案，用于研究肝脏在健康与疾病状态下的机制。