一种用于研究冰和笼形水合物结晶的微流控方法

该方案的独特之处在于，它使用户能够研究、观察并测量可溶性分子与晶体表面之间的相互作用。利用此方法已获得抗冻蛋白与冰不可逆结合的有力证据。该技术的主要优势在于能够控制微米尺度冰晶和水合物晶体的生长，并以可控方式更换其周围的溶液。

首先，将预先制备好的模具放入一个用铝箔覆盖的玻璃培养皿中。然后，通过称量固化剂与弹性体按1:10比例混合，持续搅拌约五分钟，制备30至40毫升的PDMS混合物，直至混合物呈现白色且几乎不透明。接下来，将PDMS混合物倒入装有模具的培养皿中，并在真空干燥器中脱气，直至无气泡残留。

将含有液态PDMS的模具在70摄氏度的烘箱或加热板上加热，直至形成类似橡胶的质地。然后用手术刀沿器件轮廓切割，注意推动手术刀时应向前推进而非向下按压，因为模具较为脆弱。取出切割好的PDMS器件后，将其倒置放入一个新的培养皿中。

使用钝头注射器和20号针头，根据印制的图案在装置上打孔。然后将清洗后的PDMS和盖玻片放入等离子清洗仪中。关闭阀门，打开电源、真空泵和抽气泵。

让等离子清洗机运行约一分钟。将射频（RF）调至高功率，并通过微调阀门让少量空气进入等离子清洗机。当观察窗颜色由紫色变为粉红色时，继续让等离子清洗机工作50秒，然后关闭射频。

保持泵运行一分钟，关闭后逐渐打开主阀，使空气进入等离子清洗仪。然后将PDMS表面按压到已清洁的盖玻片上，并通过轻轻上提盖玻片观察是否发生分离，以确认两者已牢固键合。用镊子固定90度钝头针的针头后，将针的一端插入Tygon管，另一端插入装置中打好的一个孔中，并对其他孔重复此操作。

在铜制冷台表面滴加少量浸油，使用无绒布擦拭，形成一层薄油膜。接着，将洁净的蓝宝石圆片放置在油膜上。然后，在蓝宝石圆片中心滴加一滴浸油，将PDMS装置置于液滴上，使装置的结构特征对准冷台观察孔的位置。

固定装置位置后，将管路固定在容纳胶带的铝盒外壁上。使用玻璃注射器向入口通道注入四到五微升的抗冻蛋白溶液，并关闭冷台盖子。启动温度控制程序，将温度设定为零下25摄氏度。

然后以大约每五秒升高1°C的速度缓慢升温。接近样品的熔点，该熔点范围可能在-1至-0.2°C之间，具体取决于抗冻蛋白溶液中所用的缓冲液。为了更好地观察单个晶体，切换至10倍或20倍物镜。

在目标位置获得单晶后，通过略微降低温度使晶体生长，直至晶体两端接触到微流控通道的壁。切换至50倍物镜后，将抗冻蛋白溶液注入通道，观察荧光强度的增加，表明蛋白溶液已成功注入通道。为记录溶液交换过程，使用NIS-Elements成像程序，确保施加的压力不过高，并缓慢将缓冲液注入微流控装置的第二个入口。

观察荧光信号的下降，其下降速率取决于施加在注射器上的压力。在制备摩尔比为1:15的四氢呋喃（THF）水溶液后，将该溶液注入微流控装置中。待THF水溶液冻结后，缓慢升高温度，直至除水合物外的所有冰完全融化，并在1°C下保持三分钟。

将温度设定为零下二摄氏度，观察在无抑制剂条件下微流控通道中形成的水合物数量。然后使用玻璃注射器将抗冻蛋白或抑制剂注入微流控通道，同时调节温度以确保已形成的晶体不会熔化或继续生长，并静置数分钟，使抑制剂分子吸附至晶体表面。通过向通道内注入不含抑制剂的溶液，进行溶液置换。

在溶液交换前后拍摄晶体的图像，并使用成像程序分析晶体及溶液中的荧光强度。已成功完成围绕冰晶的溶液交换，表明溶液交换速度相对较快。然而，较慢的交换也是可行的。

在交换完成后，可清晰观察到冰上吸附的抗冻糖蛋白分子发出的荧光强度。通过定量分析监测了抗冻蛋白的浓度，并测定了溶液和冰上的荧光强度，结果表明溶液中的荧光信号在溶液交换过程中降低了100倍，而冰表面计算得到的荧光信号则保持不变。还进行了四氢呋喃（THF）水合物的微流控实验，在允许水合物晶体吸附抑制剂分子后，将不含抑制剂的溶液注入通道中。

在使用两种抑制剂（包括用异硫氰酸荧光素标记的抗冻糖蛋白和荧光染料藏红O）进行溶液置换后，观察到了四氢呋喃水合物。该方法的关键步骤是在微流控通道中形成并分离单个晶体，以及对晶体周围的溶液进行置换。此方法也可用于其他对温度高度敏感的晶体材料，以期阐明抑制剂与这些晶体相互作用的机制。

在晶体周围进行溶液交换的能力，使研究人员得以揭示抗冻蛋白结合机制的关键信息，并发现同位素效应对冰晶生长的新现象。