利用量子点介导的免疫标记结合透射电子显微镜观察心脏中蛋白质的亚细胞定位

确定蛋白质的亚细胞定位对于阐明其正常功能及相关作用机制至关重要。该方法可帮助我们在超微结构水平上直观观察蛋白质的亚细胞定位。量子点介导的免疫标记具有更高的稳定性，抗光漂白能力强，拥有独特的发射光谱，可产生高电子密度，在组织中穿透性更好，且标记效率更高、在组织中的保留性更佳。

该过程中的多个步骤，即固定、蚀刻、封闭以及量子点的最佳浓度，都是需要优化的难点。建议尝试多种反应时间点和试剂浓度。另一个挑战是载网的操作，这需要耐心，当然也需要实践。

演示该实验操作的人员包括：Chowdhury Abdullah（博士后研究员）、Naznin Remex（我实验室的研究生）以及Brandon Hartman（本机构电子显微镜服务中心的主管）。在麻醉小鼠并打开胸腔后，使用冰冻的含3%戊二醛的0.1摩尔钠二甲胂酸盐缓冲液对心脏进行灌注，持续两分钟。采用25号、5×8英寸的针头，通过重力压力将固定液注入心脏。

心脏开始充满固定液后，立即抬起心尖以减轻压力。在距离心脏1至2毫米处剪断下方的血管，使液体排出。解剖心脏。

去除心房，将心室放入含有冰冻的3%戊二醛和0.1摩尔的二甲胂酸钠的培养皿中。固定30至60分钟后作蝴蝶状切口，再将心室放回培养皿中。用手术刀将心脏切成1立方毫米的小块。

将解剖后的心脏组织在四摄氏度下用戊二醛和二甲胂酸盐溶液固定并浸泡24小时。固定24小时后，用0.1摩尔的二甲胂酸钠缓冲液洗涤组织两次，每次20分钟。将组织从二甲胂酸钠缓冲液中取出，室温下浸入2%四氧化锇溶液中四小时。

锇酸处理后，将组织在2%醋酸钠溶液中室温浸泡10分钟。接着，将组织在2%醋酸铀酰溶液中室温浸泡1小时。醋酸铀酰染色后，依次通过梯度乙醇和丙酮对组织进行脱水。

按照文中的描述，将脱水后的组织包埋于低粘度环氧树脂中。将组织放入8毫米的微型模具中的新鲜树脂内，并在70摄氏度下过夜固化包埋的组织。找到目标区域后，使用45度超薄切片刀制备呈淡金色的超薄切片。

将这些超薄切片置于200目铜网的哑光面。开始染色时，通过在干净的石蜡膜上滴加20微升高碘酸蚀刻液来暴露抗原。将带有组织切片的干燥铜网放置于蚀刻液滴上。

将切片载网置于溶液中，在室温下孵育30分钟。将蚀刻处理的组织切片放置于一滴蒸馏水中60秒，进行洗涤。将切片载网置于一滴0.05摩尔的甘氨酸溶液中，在室温下孵育10分钟，以封闭残余的醛基。

用滤纸吸去载网边缘的残留甘氨酸溶液。将切片载网置于10至20微升封闭液中，室温孵育25分钟。用滤纸吸去载网边缘液体，将载网切片置于抗体稀释液中，室温下预处理10分钟。

在湿盒中，将载网片与一抗于室温孵育1小时30分钟。用吸水纸吸干载网，再用抗体稀释液洗涤载网片两次，每次5分钟。在湿盒中，将载网片与生物素标记的二抗孵育1小时。

网格经 blot 干燥后，用抗体稀释液洗涤网格部分两次，每次五分钟。将网格部分置于含有市售的链霉亲和素偶联量子点（QD）的溶液中，在室温下的孵育盒中孵育一小时。用铝箔覆盖孵育盒，避免光照。

使用滤纸将载网边缘的印迹液干燥后，将载网置于水滴上清洗两分钟，再用滤纸吸干载网边缘。将样品台插入显微镜镜筒中，启动泵开关以检查测角台，随后将样品台完全插入显微镜镜筒内。对目标区域进行清晰聚焦。

使用高速数码相机捕获图像，并将文件保存为 tif 格式。在线粒体膜、溶酶体以及内质网或肌质网膜与线粒体的界面处，均观察到 Sigmar1 标记的量子点。心脏切片使用兔免疫球蛋白 G 及量子点作为抗 Sigmar1 兔一抗的同型对照进行可视化观察。

在进行本方案时，一个需要考虑的重要因素是抗原的去封闭时间。如果组织切片刻蚀时间过长，高碘酸盐溶液会在薄的组织切片上产生穿孔。量子点介导的标记技术正在肿瘤检测、肿瘤分子与免疫状态分析以及组织成像中受到关注，为医学诊断开辟了新的途径。

量子点还可通过向眼部递送药物，用于光动力疗法治疗肿瘤以及眼科异常。