一种带沟槽图案的微流控装置用于研究细胞行为

我叫Jiang，是哈佛大学和麻省理工学院健康科学与技术项目的博士后研究员。我在本实验室的专业方向是开发新型的微流控预测装置，用于研究细胞行为。我能够设计出非常新颖的梯度发生装置，同时也能够将其集成到我的微流控预测装置中。

TC设备能够精确操控细胞-细胞相互作用、细胞相互作用以及细胞与生长因子的接触。因此，利用TC系统，我可以研究并理解基础细胞生物学，同时应用于发育生物学以及生物工程和干细胞生物工程领域。我叫Amir Manchi，是哈佛大学-麻省理工学院健康科学与技术部Haan实验室的本科学生。

我一直在研究微流控设备，我们尝试以概念验证的方式证明微流控设备在细胞培养以及毒性研究等不同研究中具有巨大的应用潜力。此外，我们还尝试研究并优化这些设备内部的流体特性，以分析其与流速、几何结构及其他各种参数之间的关系。目前，我们正从微加工实验室开始工作，接下来要制作一些微流控设备。为了实现微流控设备的制备，我们需要一些带有特定图案的硅晶圆，以及在其表面制备的PDMS模具。这种PDMS聚合物实际上是由两种不同组分混合而成的。

它由硅胶弹性体基础剂和硅胶弹性体固化剂混合而成。这两种组分的混合比例为10:1，即10份基础剂与1份固化剂。现在我需要取大约20克的基础剂。

我还需要两克固化剂，而固化剂的密度要小得多，取用时会流得更快，因此我必须稍微小心一些。现在大约是22克，接下来我要将基础剂和固化剂混合在一起。

因此，我将使用移液管来完成这一操作。我会尽可能充分地混合均匀。接下来，我需要将这种PDMS聚合物倒在带有微结构图案的硅片上，利用硅片上的图案来赋予PDMS模具相应的结构。

实际上，您可以看到我这里有两片硅片，原因是其中一片用于我们微流控装置的顶层，另一片用于底层。微流控装置需要两层结构，因为我们要在内部构建通道，而微流控装置的核心原理是希望在这些通道内实现流体的流动。因此，我需要将这种混合物倒在两片硅片的表面，因为该混合物内部存在大量气泡。

我想去除这些气泡，为此我们使用真空环境来排除这些气泡。我们现在回到主实验区域，正如我之前提到的，PDMS 混合物内部含有大量气泡，我们需要将其去除。我会将混合物放置在真空腔室内的硅晶圆表面。然后我会关闭腔室，并启动真空泵。完成抽真空后，我们会将 PDMS 模具放入烘箱中过夜，使其更加固化。

好了，我们现在在实验室，准备组装这些微米级叶酸装置。首先，我们需要取出已在培养箱中放置过夜的PDMS模具，这些模具已经成型，其表面形成了与硅晶圆上相同的图案。我将使用两种不同的图案：左侧可以看到的是微通道，将作为顶层；右侧可以看到一些绿色线条图案，将作为底层。

这一步将形成微装置内部的凹槽结构。我首先开始切割这些凝胶，以便获得顶层，使其能够轻松地从硅片上分离。接下来，我会将凝胶正面朝上转移到这些培养皿中，使图案面朝上。

接下来，我将对沟槽部分（即绿色线条图案）进行相同的操作，这些部分将构成底层结构。因此，在凝胶切割完成后，我将把其转移至佩特里培养皿中，并为了防止灰尘落在图案表面，我将用胶带将其覆盖。

下一步是在通道的两端打孔，以便细胞和培养基能够流入和流出。由于此处表面较宽，我无法直接看清微通道的图案，因此我将借助这个工具来观察通道位置，然后在两端进行打孔。我将在这一端打一个较大的孔，以便留有足够的余量；而在另一端则打一个较小的孔，以便能够连接聚乙二醇管路。

我们现在位于微加工实验室，下一步是将之前制备的两种不同表面进行连接。为此，需要使用这台名为等离子清洗机的设备，该过程称为等离子处理。在腔室内发生的情况是：将形成一个等离子体环境，在等离子体与表面相互作用的过程中，等离子体会破坏表面原有的弱结合状态，并将其替换为高反应活性的化学基团。

接下来，我将取出为防尘而放置在此处的胶带，并将这些模具放入腔室内。然后完全关闭这扇门，先开启电源，再启动泵，之后即可开始运行。我们将在5到10分钟后继续下一步。

现在我要关闭它，因此先关闭泵和电源，然后打开腔室。实际上这里存在负压，所以你可能会听到声音。这就是由于负压造成的，因此我要缓慢地将模具取出。

由于两个图案表面均朝上，我将取底部这一层，放在左手，再取顶部这一层，将其翻转后放置在沟槽上方，然后将两层推合在一起。使用这种等离子体处理设备的优势在于其粘合强度高且持久。您现在可以看到，顶部这一层上有通道，底部这一层上有沟槽图案，已准备好进入下一步操作。

然后将此培养室、此培养基带到这里，打开培养皿盖子。接着即可加入纤连蛋白，取出60 µL的纤连蛋白，然后将其加载到装置中。随后可通过轻轻抽吸出口，在装置内部产生一定流速，以诱导通道内表面形成薄层涂层。

之后，我们将该装置放入培养箱中，在培养箱内振动冷却一小时。一小时后，从培养箱中取出样品，使用五根锈线、三根三股锈线进行融合处理，并置于培养基中，然后使用细胞计数器进行细胞计数。

我们通常将约百万个细胞置于装置内部进行培养。因此，在消化解离后，只需用培养基清洗一到两次，然后取出细胞悬液，再将细胞悬液注入通道内部，以实现细胞在通道内的接种。操作时可使用移液器轻柔地进行液体流动控制。

总培养基和表面悬浮液通过出口细胞通常会自动接种到选择性通道和全局通道中。之后，我们将装置拆卸并放入培养箱中孵育一小时，直至细胞在通道内完全铺展。随后，我们可灌注 Annexin V 和碘化丙啶以及过氧化氢。

然后进行时间假设测定实验。我们可以取组织培养皿中的样品，制备含有2 mM DMM培养基、20 µL Annexin V、40 µL 碘化丙啶以及100 mM 过氧化氢的溶液。随后将含有Annexin V、碘化丙啶和过氧化氢的2 mL培养基溶液吸入注射器中备用。

加入两毫升培养基以及五微升碘化丙啶和过氧化氢。可将溶液直接加入离心管中，然后去除气泡，再连接C柱。此离心管为密封性良好的汉密尔顿进样瓶。

这个是三只熊。这个是一次性天花板。这个是27号针头。

这根是PE 20聚乙烯管。将溶液装入注射器后，只需完全推动活塞，反复推几次，有时轻轻敲击注射器尖端，以去除气泡，同时回抽溶液。再重复一次：完全推动以排除气泡，然后轻轻重新装填溶液。

因此，取一份餐用溶液，然后我们可以切换阀门。推动液体，将溶液通过三通阀并完全推入管路中。最终溶液会从管路末端流出，然后我们只需将管路连接到微流控装置上，开始以每分钟1微升的速度进行灌注。