C. elegans 性腺解剖与冰冻裂解用于免疫荧光及 DAPI 染色

这种解剖和免疫荧光方法被许多秀丽隐杆线虫（C. elegans）实验室所采用。该方法可适用于检测任何已有抗体或标签融合蛋白可用的蛋白质。尽管正确完成此类解剖需要一定的练习，但本实验方案具有良好的灵活性，且易于排查问题。

对我们而言，DAPI 染色总是有效，通常也能为每种抗体找到适用的条件。该技术最大的挑战在于解剖步骤。为了获得良好的生殖腺突出样本，操作时必须迅速而自信。

实践是关键。首先，将固定载玻片放置在解剖显微镜的载物台上，并将盖玻片置于固定载玻片上方。然后，用移液器吸取4 µL解剖液，滴加到盖玻片中央，再将固定载玻片移至载物台一侧，以腾出视野空间。

从 NGM 平板中挑选 10 到 20 只雌雄同体线虫，放入解剖液滴中。每个载片上最好放置约 10 只，数量不宜过多，以确保能在五分钟内完成解剖。解剖时，将解剖针的针尖交叉成 X 形，用 X 的底部将成虫固定在盖玻片表面。

接下来，将X形切口置于咽部正后方，位置大约在年轻成体体长的五分之一处，或位于头部透明区域的稍下方。然后，用剪刀式动作一次性切断动物头部，使其完全脱离体腔，并带出一个或两个半边的肠道。为了用甲醛固定样品，用移液器吸取4 µL固定液，滴加在盖玻片上，靠近含有动物的液滴边缘，注意避免直接将固定液滴入解剖液滴中，以免冲走已解剖的尸体。

用一只手的手指将盖玻片固定在载玻片上。另一只手轻轻弹动盖玻片数次，以混匀液滴。取一张带正电荷的载玻片，将其正面朝下，轻轻接触样本液滴的中心，通过液滴的表面张力将盖玻片拾起。

将载玻片放置在实验台上，在室温下准确固定五分钟。在此期间，用铅笔标记载玻片。用镊子夹住已标记的载玻片边缘，使用液氮冷冻并使样品产生裂纹，轻轻将其浸入液氮中。

松开载玻片，使其盖玻片朝上倾斜靠在烧杯侧壁，确保载玻片在10秒内完成冷冻。若使用干冰进行冷冻，需先用刀片刮去铝块表面的霜，然后牢固握住已标记的载玻片边缘，将其放置在清理干净的铝块表面，并适当向下施压，以确保载玻片与铝块充分接触。当盖玻片下方的样品结冰时，冷冻过程即在10秒内完成。

握住载玻片有标签的短边，用力取下冷冻的载玻片，并将长边一侧抵住实验台。另一只手牢固握住剃刀，将刀刃沿载玻片表面滑下，将盖玻片从样本上弹离。立即将载玻片放入盛有95%乙醇的考普林瓶中，并在乙醇中浸泡至少五分钟。

然后，在室温下用 PBST 每次洗涤载玻片五分钟，共洗涤三次，每次使用新鲜的 PBST。生殖系细胞核的荧光成像结果表明，DAPI 能强烈结合 DNA。当靶向 RAD-51（双链断裂的标志物）的抗体在减数分裂细胞核内呈现为离散的焦点，并与 DAPI 标记的染色体共定位时，免疫荧光染色即为有效。

kle-2 杂合突变体的染色体结构存在轻微缺陷，表现为 DAPI 染色略微紊乱以及双链断裂数量增加，后者反映为 RAD-51 焦点数量增多。解剖和冷冻裂解步骤均可能较难操作，因此重要的是操作时要迅速且流畅。我们建议在尝试完整方案前，先对这些步骤进行练习。

例如，您可以在较大体积的液体中进行解剖练习，比如 200 微升，然后逐步减少至盖玻片上推荐的 4 微升体积。该技术可用于共聚焦显微镜或结构照明显微镜的高分辨率成像，也可与 DNA 或 RNA-FISH（荧光原位杂交）结合使用，以观察蛋白质相对于特定序列的定位情况。