使用双光子全息显微镜评估与操控神经活动

本方案可提供关于神经活动的精确时空信息。该技术的主要优势在于能够以高时空分辨率操控和评估神经活动。该方法可能有助于阐明导致神经活动异常的神经精神障碍的致病机制。

该方法可应用于神经元及其他器官健康状况的研究。本实验操作由本实验室的博士研究生郭中天（Zhongtian Guo）进行演示。在颅骨窗植入术后一天，于手术前一小时按每公斤体重1.32毫克的剂量腹腔注射地塞米松磷酸钠，以预防脑水肿。

在体视显微镜下，使用牙科钻进行直径约两毫米的环形开颅。为减少脑组织损伤，操作牙科钻时应谨慎，保持持续轻微移动和轻度向下的压力。多次使用吸引系统清除骨碎片。

去除骨片后，使用人工脑脊液或ACSF溶液清除并冲洗脑表面残留的任何碎片。重复此清洗步骤数次，以抑制炎症反应。使用压力注射系统，设定适当压力，通过尖端直径为10至20微米的玻璃毛细管在10分钟内注射500纳升AAV溶液。

如果玻璃毛细管中 AAV 溶液的液面逐渐下降，说明 AAV 溶液正在被注入脑内。将玻璃毛细管原位保留额外 10 分钟，以防止回流。重复此操作三次，共计向脑内注入 1.5 µL 的 AAV 溶液。

使用微量移液器将2%低熔点琼脂糖涂抹于S1脑区表面，然后在颅骨开窗处放置一片玻璃窗，两侧用盖玻片固定。在琼脂糖仍处于液态时，将盖玻片轻轻压紧，以防止琼脂糖中产生气泡。

使用牙科粘接树脂胶封闭颅窗边缘。为校准全息刺激系统，将红色荧光载玻片表面置于样本平面，并将显微镜设置为活体成像模式，使用弱激发光照射。运行校准图形用户界面（GUI）。

mfile，检查参数面板并点击保存按钮。在第一步面板中点击Z扫描按钮，系统将自动生成21个不同的轴向平面，每个平面之间相距两微米，并在每个平面上随机生成三个点。移动滑动条并查看实时图像。

找到一个最佳平面，使光斑呈现最小且最亮的状态，然后点击保存按钮。这将为数字全息图自动生成一个偏移的球面波前。在第二步面板中点击“运行”按钮，然后在左侧方框上点击六个光斑。

检查实时图像。如果存在六个可区分的荧光点，则将它们的 X 轴和 Y 轴坐标输入到编辑框中，然后点击保存按钮。这将自动生成精细的变换系数，用于全息刺激与成像系统之间的坐标校准。

然后，点击步骤三面板中的“扫描”按钮。系统将生成 441 个数字全息图，以在 21×21 步的范围内对视场进行单点扫描。在列表框中切换图案时，同步查看图像变化。

调整激光功率，以获得处于成像设备动态范围内的光斑图像。将成像设备置于记录模式，然后点击播放按钮。播放完成后，在第四步窗格中点击生成权重图，并选择一幅堆叠图像。

然后关闭校准图形用户界面窗口。系统将自动生成权重图，以补偿每个光斑中不均匀的强度。将带有头固定板的AAV注射小鼠置于显微镜下，使用全息显微镜和锁模钛宝石激光器（波长调至920纳米）配合25倍物镜进行双光子成像。

打开商用成像软件的实时成像模式。调节图像探测器的电压和成像激光的功率，以优化表达GCaMP8f的神经元的亮度。采集表达该蛋白的神经元图像。

为了使用全息照明技术照亮特定神经元，请运行 SLMcontrol.m 脚本文件。单击参考图像并选择已获取的图像。

然后，单击“Spot”按钮以选择图像中神经元上的特定像素，并按键盘上的回车键完成操作。为了利用图像传感器以高时间分辨率检测神经活动，需设置曝光时间、成像区域和像素合并（binning）参数，然后进行图像采集。将小鼠放置在显微镜下并完成双光子成像后，打开商用成像软件。

在活体成像模式下，调节图像探测器的电压和成像激光的功率，以优化表达GCaMP-6m-p2A-ChRmine的神经元的亮度。采集表达这些蛋白的神经元图像，随后按照前述步骤照射特定神经元。为研究第二层和第三层神经元之间的功能连接，使用空间光调制器生成光遗传学刺激的全息模式，并将其与双光子钙成像相结合。

将成像激光的强度设置为920纳米，功率为10至20毫瓦，视野设置为256微米×256微米，测量深度为距皮层表面100至150微米处。像素驻留时间设为1.5微秒（对应2赫兹）或100纳秒（对应30赫兹）。采用2赫兹和30赫兹两种成像帧率，以检测单次全息刺激是否引发神经元的钙反应。

将全息刺激激光的强度设置为10毫瓦，该强度足以激活单个神经元。同时，在10秒基线期后，以1040纳米进行10次全息刺激，每次刺激持续50毫秒，刺激间隔为8秒，并在920纳米下成像钙离子反应。之后，将小鼠放回其饲养笼中。

此处展示了在100赫兹成像条件下，表达GCaMP8f的神经元在接受全息刺激并由图像传感器记录时的代表性图像及信号轨迹。该图显示了神经元在不同激光功率下对全息刺激的响应。此处还展示了在2赫兹和30赫兹成像帧率下，对10个不同神经元进行全息刺激期间的代表性钙离子（Ca²⁺）信号轨迹。

相同颜色表示相同的神经元。此处展示了一个评估神经元之间功能连接的示意图。当刺激橙色神经元时，红色神经元同时产生反应，表明这些神经元之间存在功能连接。

此处展示的是野生型小鼠初级体感皮层表达GCaMP6m的神经元典型图像。这些图形图像代表了在全息刺激下，以2 Hz和30 Hz成像帧率记录的典型钙离子（Ca²⁺）信号动态。在2 Hz和30 Hz两种成像速度下均可检测到神经元对全息刺激的响应性。

这些步骤对于减少脑部运动以及获得稳定结果至关重要。我们认为，该显微镜能够诱导神经元以特定模式产生行为活动。利用这一技术，我们现在能够评估并操控单个神经元的活动，并详细表征神经精神活动。