细胞内表型的自动化分析 沙门氏菌 使用 ImageJ

这种荧光显微镜方法可自动量化沙门氏菌在肠上皮细胞内的表型，从而实现对大量菌株进行可扩展分辨率的沙门氏菌研究。我们的方法兼具定量、高通量和自动化的优势，依赖于区域分析和单细胞分析。胞内行为对于多种细菌的宿主-病原体相互作用至关重要。

我们的方法可轻松适用于沙门氏菌以外的细菌病原体，有助于深入理解其致病机制。获取图像后，通过在 ImageJ 中打开采集的 .czi 文件进行单细胞分析。

通过点击图像并选择“颜色”，然后选择“拆分通道”来拆分通道。进行细胞分割时，在C1采集标题窗口中选择Z平面图像。选中C1采集标题窗口，点击图像，然后进行复制。

然后，输入所选Z平面的编号。在标题框中输入C1Zplane，取消勾选“复制堆栈”选项，然后点击“确定”以仅复制选定的Z平面图像。此时将打开一个名为C1Zplane的窗口，显示所选的Z平面图像。

现在通过选择“Process”并点击“Enhance Contrast”来增强所获得的C1Zplane图像的对比度。调整饱和像素，勾选“Normalize”，然后点击“OK”以应用对比度增强技术，获得对比度归一化的C1Zplane图像。接着进入“Process”菜单，点击“Find Maxima”，以在对比度归一化的C1Zplane图像中分割上皮细胞。

然后，为了将每个上皮细胞仅对应一个极大值点，勾选“预览点选择”并设置噪声容差。为了获得C1Zplane分割图像（一种新的类似二值掩膜的图像，显示每个标记的极大值点对应的分割颗粒），勾选“排除边缘极大值”，选择“分割颗粒”作为输出类型，然后点击“确定”。接下来，在C1Zplane分割图像中创建分割细胞的掩膜。点击“分析”，然后选择“分析颗粒”，勾选“显示掩膜”和“排除边缘”选项。

设置尺寸区间，然后单击“确定”以获得 C1Zplane 分割后的二值掩膜。单击查找表，并在工具栏中选择“反转查找表”。为对对比度归一化的 C1Zplane 图像进行阈值分割，请转到图像，选择“调整”，选择“阈值”，并勾选“暗背景”。

将自动阈值设置为默认值，并选择红色选项。调整最小截断值，直至细胞完全呈现红色，背景保持深色。单击“应用”，将对比度归一化的C1Zplane图像转换为二值图像，其中细胞为白色，背景为黑色。

此外，为了校正 C1Zplane 分割二值掩膜中细胞的分割结果，选择“Process”并点击“Image Calculator”。然后，将 C1Zplane 分割后的掩膜选为图像一，在下拉列表中选择“AND”操作，并将经过阈值化处理的对比度归一化 C1Zplane 选为图像二。点击“OK”，ImageJ 将自动将输出图像命名为“Mask of C1Zplane Segmented 的结果”。

要将 C1Zplane 中每个已分割的细胞标记为感兴趣区域，请点击“Analyze”，然后选择“Analyze Particles”。按照之前的方法调整大小，并选择“Show: Nothing”选项。勾选“Add to Manager”，将所有颗粒添加到 ROI Manager 工具中。

此外，勾选“排除边缘”选项，然后单击“确定”。通过 ROI 管理器菜单中的“更多”按钮选择“保存”，将 ROI 数据另存为 roi-cells-acquisitiontitle.zip。完成细胞分割后，切换至 C2 acquisition title 窗口以分析液泡内的沙门氏菌。

首先，进入“处理”菜单，点击“图像计算器”，在“图像1”中选择C2采集标题，并在下拉列表中选择“减去”操作。然后，在“图像2”中选择C3采集标题，勾选“创建新窗口”，点击“确定”。在“处理栈”窗口中点击“是”，将减法操作应用于整个Z栈。接着，点击“图像”菜单并选择“复制”，以复制C2采集标题窗口的处理结果。

然后检查重复的栈，点击“确定”以获取C2采集标题一窗口的结果。对C2采集标题一窗口的结果应用高斯模糊：进入“Process”菜单，点击“Filter”，然后选择“Gaussian Blur”。将Sigma值保留为2，或根据需要进行自定义。

单击“确定”，然后在“处理栈”窗口中单击“是”，对整个Z栈应用高斯模糊。通过单击“处理”并选择“图像计算器”，将C2采集标题一的高斯滤波结果从C2采集标题的结果中减去。现在选择C2采集标题的结果作为图像一，在下拉列表中选择“减去”操作，选择C2采集标题一的结果作为图像二，然后单击“确定”。在“处理栈”窗口中单击“是”，将减法操作应用于整个Z栈，从而获得一个由ImageJ自动命名的窗口，命名为C2采集标题的结果的结果。

为了从 C2 获取标题结果的背景中分离出沙门氏菌，请单击图像，选择“调整”，然后单击“阈值”。接着，勾选“暗背景”，并将自动阈值设置为 Otsu 法。调整最小截断值，直到沙门氏菌完全呈现红色，而背景保持深色。

单击“应用”，将打开一个名为“转换为二值图像”的窗口。勾选黑色背景选项，然后单击“确定”。在C2通道采集结果的二值化窗口中，选择对应于细胞内沙门氏菌聚焦平面的中间Z平面。单击图像，然后依次选择“图像堆栈”（Stacks）并选择“设置切片”（Set Slice）。

现在输入所选Z平面的编号，然后点击“确定”。接下来，通过点击“分析”并选择“设置测量”来设定每个ROI的测量参数。勾选与每个ROI总面积对应的“面积”选项。为了记录每个ROI中被阈值化像素占据的面积比例，请勾选“面积分数”和“限制为阈值”。

勾选“显示标签”以使用图像标题、通道、Z平面以及X/Y坐标为每个ROI进行标注。使用细胞内沙门氏菌选定的Z平面，记录每个细胞的标签、面积以及沙门氏菌所占百分比面积。打开roi-cells-acquisitiontitle。

通过点击文件菜单并选择打开来解压文件。然后，在ROI管理器菜单中点击测量。输出结果是一个报告所选测量值的表格。

最后，在结果窗口中选择文件并点击“另存为”，以保存结果表格。沙门氏菌在上皮细胞内的细胞侵袭、空泡载荷以及胞质内超量复制均被成功可视化。面积分析显示，与两种萨拉姆·德比（Salmonella derby）菌株相比，鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的感染比率显著更高，表明面积分析在检测不同沙门氏菌菌株定植上皮细胞能力差异方面具有有效性。

与鼠伤寒沙门菌野生型相比，德比沙门菌sipA基因缺失突变株表现出降低的超复制比率，这与sipA在诱导超复制中的作用一致。在鼠伤寒沙门菌与德比沙门菌野生型之间未观察到超复制差异。单细胞分析显示，与鼠伤寒沙门菌相比，德比沙门菌株感染细胞百分比无显著差异。

此外，鼠伤寒沙门菌德比血清型菌株产生的平均液泡载量显著低于鼠伤门菌。在鼠伤寒沙门菌与德比野生型菌株之间未观察到差异，而德比菌株sipA突变体表现出显著降低的超复制现象，这与面积分析结果一致。沙门菌包含多种具有不同毒力的血清型。

通过这种快速且自动化的方 法研究大量菌株，对于深入了解该病原体的真实毒力潜力具有重要意义。