表征生物体液中的细胞外囊泡

细胞外囊泡可作为疾病生物标志物，反映生理状态。我们的方法能够从小体积泪液样本中提取丰富的数据，推动生物体液中细胞外囊泡的研究。关键的实验挑战包括从小样本中获得足够的细胞外囊泡浓度、在分离过程中尽量减少样本损失，以及优化分析以防止芯片信号过饱和或检测信号过弱。

该方案跳过了分离步骤，缩短了处理时间，并允许从微量样本体积中分析细胞外囊泡，因此非常适合泪液等有限的生物样本。无创生物标志物对于角膜疾病早期检测和管理至关重要。细胞外囊泡生物标志物可实现疾病监测、个体化治疗、提高患者依从性，并改善生活质量。

本实验室率先对圆锥角膜（KC）患者泪液样本中的细胞外囊泡进行分析，鉴定了独特的泪液细胞外囊泡（tEV）特征。这为未来的诊断方法及以细胞外囊泡为靶点的治疗策略奠定了基础。首先，将生物样本和四跨膜蛋白芯片放置于工作台。

用移液器将70微升已与人四跨膜蛋白检测试剂盒溶液B预混的人类生物样本加入芯片中。将薄膜置于芯片洗涤板上，以防止样本蒸发。16小时后，将该板放入芯片清洗仪中。

将其固定到位并盖上盖子。在芯片清洗仪上选择 CW-TETRA v0 选项。在芯片清洗的同时，每张芯片准备 300 微升封闭溶液。

每个芯片的封闭液中加入 0.6 微升的每种抗体。将封闭液与抗体混合液涡旋振荡，以确保充分混匀。芯片洗涤完成后，在每个芯片上方加入 250 微升含有抗体混合液的封闭液。

然后关闭盖子并按“Continue”。当芯片清洗仪发出提示音时，取下芯片清洗板。将芯片沿斜坡向上移动。

将微孔板放回芯片清洗仪中，确保其牢固锁定到位。关闭盖子并按“继续”。首先，打开纳米颗粒分析仪。

启动连接至纳米颗粒分析仪的桌面扫描软件程序。选择芯片文件夹以选定每一张四跨膜蛋白芯片，并将其定位在卡盘的芯片位置。单击芯片位置下方的三个方块以开启荧光。

方块将变为黄色、蓝色和红色。按住卡盘盖并将其拉出以取下。然后将载有样品的四跨膜蛋白芯片牢固地固定在卡盘上。

将卡盘盖上的销钉与孔对齐并向下按压。滑动盖子以将其锁定到位。然后将卡盘放置到载物台上，并将其锁定。

接下来，在软件界面中点击“扫描芯片”，然后点击“确定”。当载物台完全移入仪器内部后，关闭门。扫描完成后，打开门以弹出载物台并核对结果。如果扫描成功，丢弃芯片。

将下一组芯片放置到卡盘上。或者，将空的卡盘放回载物台。使用完毕后退出软件并关闭仪器。

在CD63、CD81和CD9通道中观察到细胞外囊泡的最佳荧光水平，而MIgG对照通道保持黑色，证实了对照的特异性。对于生物液体，CD81信号有所降低。CD63、CD81和CD9通道中无荧光信号表明不存在细胞外囊泡。

荧光过度饱和现象明显，由于标记过度，难以分辨有效数据，尤其在CD63、CD81和CD9通道中。