细胞条件培养基中外泌体的流式细胞术分析

细胞外囊泡正越来越多地被用作多种疾病领域的诊断生物标志物及潜在治疗工具。流式细胞术是通过表面标志物对细胞外囊泡进行表征的最直接分析方法，该方案可用于分析特定尺寸的颗粒，具有快速、高效的特点，且适用于常规流式细胞仪，无需特殊设置或专用仪器。尽管本方案主要用于对特定条件和培养基来源的细胞外囊泡进行分类，但其应用可拓展至血液来源的细胞外囊泡分类，有望用于替代患者的侵入性组织活检。

对于初次接触该方案的研究人员，必须执行设置方法部分中描述的步骤，并严格遵循所演示的操作策略。首先，用含0.2%猪皮明胶的PBS溶液涂覆55平方厘米的培养皿。15分钟后，弃去溶液，将4.4×10⁵个心脏前体细胞以7毫升Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）接种至每个培养皿中，培养基中添加20%胎牛血清和1%青霉素-链霉素，于37°C、5%二氧化碳条件下培养。当细胞融合度达到约80%时，用不含钙和镁的Dulbecco PBS洗涤细胞两次，并加入10毫升无血清外泌体生成培养基进行培养。

培养7天后，将每块培养板的条件培养基收集到一个单独的聚丙烯离心管中，离心以去除任何细胞碎片。将上清液转移至一个100千道尔顿的离心过滤管中，并通过额外的离心步骤浓缩澄清后的条件培养基。将浓缩后的液体转移至微量离心管中进行最终的台式离心，然后将上清液加入聚碳酸酯厚壁微量离心管中。

用 PBS 填充试管，至终体积为 3.2 mL，并将样品加入钛制固定角度转子中。然后将转子放入台式超速离心机中进行超速离心，再用 100 µL 新鲜 PBS 重悬沉淀。为进行纳米颗粒追踪与分析定量，取 1 µL 超速离心后的样品，加入 999 µL PBS 中稀释，然后将样品加载至 1 mL 注射器中，避免产生气泡。

将注射器装入检测室的进样口，然后打开激光器。使用捕获按钮启动相机并调节焦距。随后，记录至少三个不同的帧，每个帧持续60秒，并在软件中使用批处理选项分析这三个不同的采集数据。

为准备采集样本，首先将适当实验用的单克隆抗体偶联捕获微珠按1:1:1的比例加入微量离心管中，并涡旋振荡以混匀所得的捕获微珠混合液。接着，向每1微升捕获微珠混合液中加入适量体积的样本，以获得每项检测浓度为1×10⁸个颗粒加上1.2×10⁵个微珠的混合物。向标记为“微珠”的试管中加入1微升微珠作为阴性对照，并用新鲜PBS将各管体积调整至100微升。

然后将试管放入恒温混匀仪中，在400转/分钟的振荡条件下，于4至10摄氏度孵育过夜。次日，将样品转移至圆底96孔板中，并向每孔加入相应的荧光标记抗体。在4至10摄氏度孵育1小时后，向每孔加入100微升PBS缓冲液，并打开采集软件。

选择流式细胞仪及系统启动程序，启动仪器并新建实验。创建实验模板，选择并添加培养板。选择样本在培养板上的位置，然后点击设置为样本孔。

按照命名规则输入样本名称，打开通道选项卡，并选择适当的荧光信号通道。现在将酶标板装入仪器中，然后点击点图，创建新的前向散射面积对侧向散射面积的点图。

选择“初始化”以启动激光器和流体系统，然后单击“运行”以开始采集。调整比例，使细胞群位于前向散射光与侧向散射光图的中央，并在整个样本群体周围绘制微球门控，以排除碎片。单击“停止”和“点图”，生成前向散射光高度对前向散射光面积的点图，并对微球群体进行门控。

围绕较大的细胞群重新绘制一个门，命名为单一群体（Singlets），然后点击点图（dot plot），为每个实验中使用的荧光染料创建一个荧光信号对侧向散射面积的点图。将新的点图设门于单一群体（Singlets）上。随后选择需要记录的事件数，并点击记录以开始实验数据采集。

分析结束后，将采集文件载入相应的分析软件，并新建一个实验方案。为每个文件创建点图，方法如前所述，并将所有散射轴设置为线性刻度，所有荧光轴设置为对数刻度。然后在相关信号通道中显示荧光几何平均值，以计算不同细胞外囊泡制备样品中平均荧光强度的总体变化。

在测试不同条件以确定达到平均荧光强度曲线对数生长期初期所需的最少细胞外囊泡总量后，确定每染色样本的最低颗粒数为每份 1×10⁸ 个颗粒。为使 1×10⁸ 个颗粒获得最强信号且避免非特异性抗体结合，经测定，抗 CD9_FITC 和抗 CD63_PE 抗体的最佳浓度均为 10 微克/毫升，抗 CD81_PE 抗体的最佳浓度为 5 微克/毫升。为验证该方法适用于分析杯状细胞外囊泡而非膜碎片，对细胞外囊泡进行了超声处理，结果显示，仅 30 秒超声后平均荧光强度即显著降低，机械破碎 1 分钟后则完全检测不到荧光信号。

X 自心脏前体细胞中的纯化结果显示，从两种细胞群体中均能获得表达低水平 CD9 以及高水平 CD63 和 CD81 的细胞外囊泡。此外，尽管无需超速离心即可明确识别 X 的表面标志物，但该富集步骤可显著增强这些标志物的平均荧光强度。在处理细胞外囊泡时，较小的纳米级颗粒沉淀物容易被遗漏。

因此，必须严格遵循本方案中演示的每一个步骤。目前，将细胞外囊泡用作生物标志物是最新兴的研究领域之一。不久的将来，该技术有望转化为临床诊断应用，成为一种替代性筛查工具。