提高抗原内化的颗粒稳定乳液对细胞亲和性

我们开发了由PLGA纳米颗粒稳定的皮克林乳液。该皮克林乳液增强了细胞对抗原蛋白细胞的亲和力，有效促进抗原的内化。这种纳米颗粒稳定的皮克林乳液制备简便，且能高效递送抗原。

此外，采用了一种方法来监测乳剂与细胞的亲和力，并阐明其内化过程。本方案为设计具有高效细胞摄取和有效抗原内化的新型制剂提供了指导，从而为高效疫苗的开发建立了平台。首先，将100毫克聚乳酸-羟基乙酸共聚物加入10毫升丙酮与乙醇按4:1比例配制的混合溶液中，作为油相。

在通风橱中，将20毫升PVA水溶液置于磁力搅拌器上，以每分钟400转的速度搅拌。使用注射泵将5毫升油相逐滴加入PVA溶液中。然后在通风橱中持续搅拌混合物，直至有机溶剂完全蒸发。

有机溶剂挥发后，将混合物在15,000 G条件下离心。洗涤三次或更多次，直至最终洗涤水清澈透明。将洗涤后的PLGA纳米颗粒重新悬浮于两毫升去离子水中，并在零下80摄氏度下冷冻24小时。为表征PLGA纳米颗粒的粒径和zeta电位，取10微升PLGA纳米颗粒加入一毫升去离子水中，制成稀释液，然后将稀释液转移至DTS1070样品池中。

打开计算机和动态光散射分析仪，然后将DTS1070样品池放入DLS系统中。点击Zetasizer软件，创建新的测量文件以设置测定程序。

然后启动测定程序，以获得粒径和泽塔电位分布。为制备由PLGA纳米颗粒稳定的皮克林乳液（PNPE），将冻干的PLGA纳米颗粒以每毫升4毫克的浓度加入去离子水中，随后加入角鲨烷作为油相。使用水浴超声仪，通过一步超声法在100瓦功率下超声处理5分钟，制备PNPE。

取20微升PNPE与1毫升去离子水稀释。取20微升乳液滴于载玻片上。使用光学显微镜在40倍放大倍数下观察乳液的形态和均一性，并拍摄照片。

按下电源按钮开启匀胶仪。按下控制按钮，设置涂覆时间和转速。将氮气管连接至匀胶仪，并调节气体钢瓶的减压阀至0.4千帕。

将洁净的芯片放置在匀胶机的吸盘上。将100微升多聚-L-赖氨酸逐滴加至二氧化硅传感器的中心位置，然后关闭匀胶机的顶盖。按下启动按钮开始涂覆样品，完成后停止机器。

关闭真空泵，关闭电源和控制按钮，取下经多聚-L-赖氨酸修饰的二氧化硅传感器。为测定仿生细胞外囊泡与PNPE的黏附性，启动计算机、电子单元和蠕动泵，在软件界面右下角激活温度控制功能，确保设定温度比室温低约1摄氏度。按照操作说明将经多聚-L-赖氨酸修饰的二氧化硅传感器放入流动池中，并连接流动池与流泵之间的测量管路。

将流动池放入流动模块系统中。单击采集工具栏，选择“设置测量”以在所用通道中搜索芯片的1、3、5、7、9和11个倍频程。为校正基线，单击“开始测量”，使空气进入流动模块，直至空气基线平滑。

用去离子水冲洗 10 至 15 分钟，使溶液基线重新达到平衡后，以 50 微升/分钟的流速将制备好的 PNPE 溶液泵入流动模块，使硅 dioxide 传感器表面实现平衡吸附。以 50 微升/分钟的流速将制备好的仿生细胞外囊泡（bEV）溶液泵入流动模块，以追踪 bEV 黏附至 PNPE 表面的过程。将骨髓来源的树突状细胞用 1640 完全培养基孵育 7 天，随后在 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中，以每孔 1 × 10⁶ 细胞的密度接种至小型共聚焦激光培养皿中过夜培养。

将0.5毫升Cy5标记的卵清蛋白与0.5毫升PNPE混合，孵育1小时，然后在5,000 ×g条件下离心20分钟以去除液相抗原，从而制备疫苗制剂。用200微升去离子水重新悬浮后，在超净工作台中将10微升该制剂加入小型共聚焦激光培养皿中，并与骨髓来源树突状细胞共培养6小时。移除细胞培养液后，用预热的磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次。

用 4% 甲醛溶液与 PBS 在室温下固定细胞 10 分钟。在室温下用 PBS 洗涤细胞两到三次，每次 10 分钟。用 100 微升 0.5% Triton X-100 溶液在室温下对细胞进行透化处理，持续 5 分钟。

用 PBS 再次洗涤细胞后，向小共聚焦激光培养皿的玻璃底部分加入 200 微升荧光素异硫氰酸酯标记的鬼笔环肽工作液，覆盖细胞，在室温避光条件下孵育 30 分钟。用 PBS 洗涤细胞三次，每次五分钟，随后用 200 微升 DAPI 溶液对细胞核复染约 30 秒。进行图像分析时，依次开启共聚焦显微镜的硬件设备，包括激光器、共聚焦系统、显微镜和计算机。

点击软件并选择尼康共聚焦显微镜以进入测试系统。在共聚焦显微镜系统中，按照指定顺序开启各个单元。首先，设置 FITC、DAPI 和 Cy5 通道，并调节相应的增益电压（HV）和偏移量。

然后选择100倍油镜，在镜头上滴一滴雪松油，将含有染色骨髓树突状细胞的小型共聚焦激光皿置于显微镜载物台上。点击扫描按钮。在荧光显微镜下，通过调节x轴、y轴和z轴移动来定位目标细胞。

调节激光强度、图像大小及其他参数，以获取高质量的共聚焦图像。最后，点击采集按钮并保存图像。使用QCM-D追踪仿生细胞外囊泡与PNPE的黏附情况。

频率立即下降，表明仿生细胞外囊泡在与PNPE接触后迅速发生黏附。此外，随着仿生细胞外囊泡浓度的增加，ΔF逐渐降低，反映出浓度依赖性效应。即使在80微克/毫升的高浓度下，PLGA微粒和表面活性剂稳定的纳米乳液与仿生细胞外囊泡的结合也较弱，这可能是由于缺乏与免疫细胞的接触位点所致。

氰基-5标记的卵清蛋白荧光信号表明，与PLGA微粒和表面活性剂稳定的纳米乳液处理组相比，PNPE处理组细胞内化抗原的总量显著更高。细胞摄取的定量分析显示，经PNPE处理的骨髓树突状细胞的荧光相对强度显著高于经PLGA微粒和表面活性剂稳定的纳米乳液处理的细胞。实验结果表明，PNPE可促进抗原的内化，并有效将抗原递送至细胞内。

为了获得均匀的乳液，在超声处理过程中必须持续摇动混合物。